中华绒螯蟹精子顶体内蛋白质种类及其功能

Animal Sperm is highly specialized cell in structure and function. The acrosomal structure and its protein composition plays important roles during the fertilization. Studies about the relationship between the acrosomal proteins and fertilization process are currently focused on mammals. Eriocheir sinensis belongs to the Class Crustacea, Decapoda, Reptantia, Eriocheir. They distribute widely in eastern coast in China, and have a higher economic value in Eriocheir. The sperm of E. sinensis is aflagellated, motionless, and with a uncondensed nucleus, which is the typical characteristics in Reptantia. And the acrosome is composed of apical cap, acrosomal tubule and acrosomal vesicle. Previous research suggested that acrosome contains protein and PAS-positive substance, and the types of protein and their functions have not yet been elucidated exhaustively. This project will be used mature sperm of E. sinensis and the materials of different stages of acrosomal reaction and fertilization process, systematically study acrosomal protein types and their function, taking advantage of dimensional electrophoresis, high performance liquid chromatography, LC-MS, amino acid sequence analysis, immunofluorescence, immunoelectron microscope, bioinformatics et al. The research results will lay the foundation for exploring the mechanism of acrosomal reaction and fertilization, and provide data for the molecular mechanism of acrosomal formation, which has an important theory value. It will also be of great practical significance for sperm quality evaluation, germplasm conservation and breeding.

动物精子是一类结构和功能都高度特化的细胞，精子顶体结构和蛋白质组分在受精过程中起着决定性的作用，该方面研究目前主要集中在哺乳动物。中华绒螯蟹隶属于甲壳纲、十足目、爬行亚目、绒螯蟹属，广泛分布在我国东部沿海的通海水系，在绒螯蟹属中经济价值最高。中华绒螯蟹精子具有爬行亚目动物的典型特征，即具有无鞭毛、不运动、非浓缩核特征；其顶体包括头帽、中央管和顶体囊结构。研究认为其顶体含有蛋白质和PAS阳性物质，而有关蛋白质种类及其功能至今尚未阐明。本项目结合中华绒螯蟹成熟精子、体外顶体反应与受精过程不同阶段材料，利用双向电泳、高效液相色谱、液相色谱与质谱联用、氨基酸序列分析、免疫荧光、免疫电镜、生物信息学等技术方法，系统研究其顶体蛋白质种类与功能。研究结果为探明其顶体反应与受精机理奠定基础，为阐明其顶体形成分子机制提供资料，也为其精子质量评价、种质保护及良种培育等提供基础依据，具有重要的理论价值和实践意义

动物精子顶体是一种特殊的膜性细胞器，对于受精至关重要。不同于哺乳动物精子结构，中华绒螯蟹精子顶体占比较大，呈球形或椭球形；顶体蛋白对于精子入卵过程非常重要，但其种类至今未见报道。本项目获得了中华绒螯蟹精细胞前顶体囊蛋白、精子顶体反应释放蛋白、精子亚顶体结构头帽蛋白的蛋白质组学数据，并对其中部分蛋白进行了免疫荧光定位及功能分析；确定了受精前，精子酪氨酸磷酸化蛋白的变化。结果如下：（1）分离前顶体囊，鉴定到前顶体囊蛋白170种，主要包括细胞骨架蛋白、钙结合蛋白、细胞连接蛋白、分子伴侣、激酶类、水解酶等。（2）诱导精子顶体反应，鉴定到顶体反应释放蛋白272种蛋白，脱氢酶类、糖蛋白代谢相关酶类和激酶类占主要比例。（3）分离亚顶体结构头帽，鉴定到头帽蛋白164种，包括细胞骨架蛋白、酶类、肌钙蛋白、脂质运载蛋白等。（4）免疫荧光结果显示，有些蛋白不存在于精原、精母细胞，精细胞时期开始积累，到成熟精子分布于顶体中（如REA蛋白、SMC4蛋白等）；有些蛋白存在于精原细胞、精母细胞、精细胞、精子的不同部位（如PNA受体、DLP等）；有些蛋白存在于精原、精母细胞的细胞核，到精子则分布于顶体（如H4S1ph、H3K56ac等）。（5）成熟精子仅有顶体囊膜蛋白的酪氨酸残基磷酸化；受精前，精子顶体管处的蛋白也存在酪氨酸磷酸化现象；质谱鉴定酪氨酸磷酸化蛋白，成熟精子236种，雌蟹纳精囊中的精子204种，纳精囊分泌物处理的精子222种。. 上述结果为国际中华绒螯蟹研究中的首次，对于系统探明中华绒螯蟹精子顶体形成和受精过程分子机制提供了基础的资料；同时也为精子质量评价，遗传育种及良种选育提供了基础依据；为十足目甲壳动物、甚至其他动物乃至人类相关研究提供借鉴参考，具有重要的理论价值。