Syk基因在奶牛乳腺泌乳过程中的功能研究

In China, the raw milk yield and quality of dairy cow is still lower than the average level of the world. In order to increase the milk production and quality of dairy cow in our country, we screened the differential expressioned genes in lactation by digital gene expression profiles sequencing technology.In these genes,Syk is one of the important gene in mammary gland lactation. In this sutdy,overexpression and RNA interference technologies will be used to research the function of Syk in bovine mammary epithelial cells. qRT-PCR, Western blotting, immunohistochemistry technologies will be used to detect the expression of Syk. In the end, the signal transduction pathway in lactation mammary gland by Sky will be detected. The objective of this study is to find the molecular regulation mechanism of these genes in lactation of dairy cow. All these results will help to improve raw milk quality of dairy cow and provide the research base in high-quality dairy breeds.

目前我国奶牛饲养业中奶牛单产和原料奶品质普遍不高，为了给畜牧业生产提供有价值的试验数据，实现多产奶、产好奶这一目标，本课题选择我国饲养范围最广的荷斯坦奶牛作为实验动物，采用数字基因表达谱测序技术高通量地筛选奶牛乳腺泌乳功能相关基因，其中Syk基因在不同生理状态奶牛乳腺中呈现规律性分布,通过相关分析确定其为具有泌乳调控功能的目标基因。在奶牛乳腺上皮细胞中使用基因过表达和RNA干扰技术对Syk基因进行功能鉴定；通过荧光定量RT-PCR、Weatern blot、免疫组化和原位杂交等技术定量和定位检测Syk基因表达，获得完整的表达数据；分析Syk基因调控泌乳机能的信号转导通路以及调控方式。其目的是探索奶牛乳腺产奶过程中的分子调控规律,研究通过基因调节泌乳性状的可行性。本课题采用功能基因组学的方法来研究畜牧业生产中面临的难题，其研究成果将会为改善原料奶品质、优质奶牛品种的选育等工作提供研究基础。

本研究以荷斯坦奶牛为实验动物，尝试采用分子生物学的研究方式明确奶牛乳腺发育及泌乳过程中的分子调控规律。主要研究内容包括：采用数字基因表达谱测序技术分析不同生理状态下奶牛乳腺组织中的基因表达状况；采用Western blot和免疫荧光等技术系统分析SYK基因在不同生理状态奶牛乳腺组织中的表达状况；通过基因过表达及RNAi的方式改变SYK基因在体外培养的奶牛乳腺上皮细胞中的表达水平，研究其在奶牛乳腺上皮细胞中的功能；分析SYK基因发挥调控奶牛乳腺上皮细胞增殖的信号通路。经过数字基因表达谱测序获得了基因表达谱数据，其中泌乳期高乳品质相对于低乳品质奶牛乳腺共有66个高表达基因，139个低表达基因；而泌乳期高乳品质与干乳期奶牛乳腺基因相比，有527个高表达基因，214个低表达基因；泌乳期低乳品质与干乳期奶牛乳腺基因相比之下，高表达基因达到749个，而低表达基因有294个。Western blot和激光共聚焦结果显示干乳期奶牛乳腺组织中SYK的表达显著高于泌乳期的奶牛乳腺组织。在干乳期的荷斯坦奶牛乳腺中，SYK主要在乳腺导管上皮细胞的胞质中表达。而在泌乳期，SYK主要在奶牛乳腺腺泡上皮细胞的胞质中表达。基因干扰和过表达结果显示SYK表达降低时，奶牛乳腺上皮细胞的增殖能力下降，β-酪蛋白的表达量降低，同时与细胞增殖相关信号分子AKT1和MAPK等蛋白表达量也相对降低；而SYK过表达时，细胞增殖增加、β-酪蛋白、AKT1和MAPK的蛋白表达量上调。双荧光素酶报告基因系统研究结果显示奶牛乳腺上皮细胞中SYK可以激活AKT1启动子的活性，其作用位点位于AKT1启动子区-439~+83bp的序列范围。这些结果表明 SYK是奶牛乳腺上皮细胞增殖与分化的调节因子，SYK基因通过调节AKT1的转录活性促进奶牛乳腺上皮细胞增殖，为干乳期乳腺组织重建做准备。这项研究结果可以丰富泌乳生物学理论，为提高牛奶产量和质量提供一定的理论依据，对促进我国乳产业的进一步发展具有重要的理论意义和生产实际意义。