鸡爪槭ApTCP2调控叶形发育的分子机理研究

Acer palmatum is a famous ornamental tree in the world, which provides high ornamental and economic value. Leaf shape is one of the most important ornamental traits of Acer. A transcriptome sequencing of ‘Jinlinghuangfeng’ and ‘Jinlinghuangyu’ was carried out and a leaf index development gene ApTCP2 was found, but the mechanism involved in regulating leaf index development remained unclear. In present proposal, we aim to clear the basic functions of ApTCP2 via transformation of Arabidopsis. The miR319 cleavage site is used to verify an transformation of mutant jaw-D, the miR319 regulatory mechanism will be clarified. Using yeast two-hybrid to screen ApTCP2’s interaction proteins in ‘Jinlinghuangyu’ based on its interaction with ApTCP2 in vivo, then using bimolecular fluorescence complementation (BiFC), GST Pull-down and Co-Immunoprecipitation（CoIP）to confirm the interaction in vitro and in vivo. Together, the present proposal will disclose the mechanism of ApTCP2 complex in regulating the leaf index development of Acer, enrich the understanding of how TCP play roles in leaf index development, which will provide the candidate genes for improvement of leaf index development. Therefore, the present proposal is of both theoretical and practical significance.

鸡爪槭是世界著名彩叶树种，具有很高的经济与观赏价值。叶形是鸡爪槭最重要的观赏性状之一。我们对鸡爪槭‘金陵黄枫’和其羽裂芽变品种‘金陵黄羽’叶片进行转录组测序，发现叶形发育相关转录因子ApTCP2表达量下调，但其调控叶形发育的具体机制尚不清楚。本研究拟通过转化拟南芥明确ApTCP2基本功能；通过miR319剪切位点验证和转化拟南芥突变体jaw-D，阐明miR319对其调控机制；通过酵母双杂交技术筛选ApTCP2互作蛋白，并用双分子荧光互补（BiFC）、GST Pull-down和免疫共沉淀（CoIP）进行验证，再通过转基因手段对筛选出的目的蛋白基因进行功能鉴定，最终阐释ApTCP2复合体调控叶形发育的分子机制。该研究不仅能丰富TCP转录因子调控叶形发育的理论基础，也为鸡爪槭叶形改良提供基因资源，具有重要科学意义和应用前景。

鸡爪槭是世界著名彩叶树种，具有很高的经济与观赏价值。叶形是鸡爪槭最重要的观赏性状之一，揭示鸡爪槭叶形调控网络机制，可为鸡爪槭叶形改良提供基因资源，具有重要的科学意义和应用前景。本研究通过对鸡爪槭‘金陵黄枫’和其突变体‘金陵黄羽’叶片进行转录组测序，发现叶形发育相关转录因子ApTCP2在‘金陵黄枫’和突变体‘金陵黄羽’中差异表达，同时检测发现microRNA 319（miR319）也差异表达。本研究克隆并获得了ApTCP2基因，并对其进行功能鉴定。发现ApTCP2在根，茎和叶中均有表达，其中在叶中表达量最高。ApTCP2亚细胞定位于细胞核中，在酵母中没有转录激活活性。将ApTCP2和ApmTCP2（与ApTCP2同义变化的mRNA序列，与miR319的序列互补性降低）过表达jaw-D突变体（miR319功能获得型突变体），ApTCP2和ApmTCP2均回补了jaw-D突变体叶片缺陷的表型。过表达ApTCP2和ApmTCP2还影响了拟南芥的花期，促进了叶片衰老。在ApTCP2和ApmTCP2过表达株系中，茉莉酸（JA）合成途径关键基因（LIPOXYGENASE [AtLOXs]；AtLOX2，AtLOX3和AtLOX4）表达量升高。研究结果表明，ApTCP2通过miR319发挥多种作用，包括调节叶片形态发生，影响开花和促进叶片衰老，并且至少通过影响JA生物合成可以部分实现这些作用。本研究还构建了鸡爪槭叶片不同发育时期的酵母双杂交文库，用于筛选ApTCP2互作蛋白。利用酵母双杂交技术筛选获得ApTCP2互作蛋白ApTCP4-1，并对其进行共转酵母和BiFC验证。进一步研究发现ApTCP4-1亚细胞定位于细胞核中，在酵母中具有转录激活活性。本研究还获得了ApTCP4-1过表达野生型拟南芥和jaw-D突变体株系，并对其进行表型分析，发现过表达ApTCP4-1可以回补jaw-D突变体叶片缺陷的表型，更多表型观察和互作机制还在持续研究中。