鸡爪槭黄叶突变体叶片呈色分子机理研究

Acer palmatum is a famous ornamental tree in the world because of its colorful foliage; but leaves of most cultivars are green in vigorous growth period. Discovery of yellow-leaf mutant not only supply us new source of ornamental plant, but also supply excellent material for studying mechanism of leaf color appearance of colorful foliage plants. Using the yellow-leaf mutant and the green -leaf wild type of Acer palmatum as material, the bidirectional cDNA suppression subtractive library will be constructed. Based on High-throughput sequencing of the transcriptome and bioinformatics, the important gene associated with leaf color of Acer palmatum can be achieved by large-scale sequencing and comparative studying on the diversity sequence. And expression of the important gene will be studied by using qRT-PCR. The key genes which control the yellow-leaf appearance will be cloned by using homologous cloning and RACE; and the gene function will be verified by being transformed into model plant. This work can help us master the molecular mechanism of the leaf color appearance in Acer palmatum and promote the breeding process by genetic engineering in color-leaf plants.

鸡爪槭是世界上著名的色叶观赏树种，但多数品种在旺盛生长期叶片呈绿色；鸡爪槭黄叶突变体的发现，丰富了观赏植物资源并为彩叶植物呈色机理研究提供了良好试材。本课题以旺盛生长期叶色金黄的鸡爪槭黄叶突变体为主要研究对象，选取黄叶突变体与绿叶野生型植株的典型叶片构建双向cDNA抑制消减文库；对文库进行大规模测序并对比研究正反向文库的差异序列，结合对叶片转录组高通量测序以及生物信息学分析，从而获得鸡爪槭叶色变异相关的重要基因信息，并通过qRT-PCR等方法对不同叶色鸡爪槭材料的重要基因进行表达研究。利用同源克隆及RACE等手段克隆控制黄叶表现的关键基因，通过转化拟南芥等模式植物验证基因功能，以探明鸡爪槭叶片呈色的分子机理，进而促进鸡爪槭等彩叶植物基因工程育种进程。

鸡爪槭是世界著名色叶观赏树种，但多数品种在旺盛生长期叶片呈绿色；鸡爪槭黄叶突变体的发现为彩叶植物呈色机理研究提供了良好试材。本课题选取黄叶突变体与绿叶野生型作为试材，借助高通量测序以及生物信息学分析，探索鸡爪槭叶片呈色的分子机理。通过对比研究鸡爪槭黄叶、绿叶两种不同颜色叶片的叶绿素、类胡萝卜素和花青素并结合Illumina测序平台分析了差异表达基因。在突变体黄鸡爪槭中测得48436 个unigenes和1913个差异表达基因（784个表达上调基因和1129表达下调基因）。筛选得到了一些叶色形成和抗应激能力的差异表达基因，如原卟啉原IX氧化酶基因PPX II，镁原卟啉单酯化酶基因MTC，原叶绿素酸酯氧化还原酶基因PORA，叶绿素酶基因Chlase/CLH1。研究中进一步以黄叶突变体与绿叶野生型为材料进行消减杂交，构建了双向的cDNA抑制消减文库。对抑制消减文库进行大规模测序，对比研究正反向文库的差异序列，与数据库进行比对，获得了鸡爪槭叶色变异相关的重要基因，并利用qRT-PCR 等手段进行表达差异的验证。相关重要基因在绿、黄、红3种不同颜色品种叶片中表达差异较大，其中黄酮醇合酶/黄烷酮3-羟化酶在红色和绿色叶片中表达，而黄色叶片中几乎没有表达；一种细小蛋白异构酶的表达模式也类似，表明黄色叶片中的花青素代谢途径可能与绿色和红色中的差异较大。根据转录组测序数据及双向cDNA 抑制消减文库的研究结果，挖掘的鸡爪槭突变体叶色呈现的关键基因，分离并比较其序列特点，同时结合叶绿素合成代谢途径中关键基因的表达模式进行比较分析。结果显示：鸡爪槭黄叶突变体与绿叶野生型4个叶绿素合成代谢相关基因PPX II、MTC、PORA与Chlase/CLH1的编码区序列长度一致，但是它们的碱基及氨基酸序列分别存在3～17个位点和0～7 个位点的差异。利用植物表达载体pRI201-AN-GUS为基本骨架，通过Nde I酶切位点分别将PPX II（黄色材料）、Chlase/CLH1（黄色材料）、MTC（绿色材料）和PORA（绿色材料）基因编码区正向构建到35S 启动子驱动的上述载体上，利用携带重组载体的根癌农杆菌侵染拟南芥，鉴定并获得转基因T1代株系，目前正在筛选表型，检测转基因植株中叶绿素代谢途径各基因的表达变化，揭示鸡爪槭黄叶突变体叶色突变性状形成的分子机理。