O1群 ElTor霍乱弧菌甘露醇代谢差异的机制研究

传统的病原微生物致病性研究多关注在毒素的分泌，粘附定居和侵袭，破环宿主免疫和细胞功能等方面。目前，细菌毒力表型与其代谢之间的关系受到愈来愈多的关注，细菌重要的代谢通路被认为是病原菌毒力的重要组分。.霍乱弧菌是引起甲类传染病霍乱的病原体，O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株和非产毒株在甘露醇代谢方面存在明显的差异，并且该差异与其是否携带霍乱毒素基因有高度的相关性，表现为产毒株慢发酵甘露醇，非产毒株快发酵甘露醇。在霍乱弧菌染色体上存在甘露醇磷酸烯醇式丙酮酸转移酶系统（PTS）基因簇，其甘露醇转运的相关功能在我们的前期实验中已得到证实，但其转运代谢甘露醇能力差异的内在机制仍不清楚，本课题拟从研究甘露醇相关PTS基因簇的转录，调控等方面入手，进一步探索甘露醇利用代谢的过程及产毒株和非产毒株甘露醇代谢差异的机制。

霍乱弧菌是引起甲类传染病霍乱的病原体，O1群El Tor型霍乱弧菌产毒株和非产毒株在甘露醇代谢方面存在明显的差异，表现为产毒株慢发酵甘露醇，非产毒株快发酵甘露醇。本项目从研究霍乱弧菌甘露醇磷酸烯醇式丙酮酸转移酶系统（PTS）基因簇的转录，调控等方面入手，探索产毒株和非产毒株甘露醇代谢差异的机制，主要的研究内容和成果包括：.全局性转录调节子cAMP-CRP复合体直接结合于mtl的启动子区的五个CRP结合位点，转录水平正性调节霍乱弧菌甘露醇代谢，虽然这不是产毒株和非产毒甘露醇代谢差异的原因；并且这些结合位点表现出不同的CRP亲和活性，与大肠杆菌相比，霍乱弧菌中CRP结合位点序列的核心碱基更趋不保守。不同于大肠杆菌，FruR不参与霍乱弧菌甘露醇代谢调节。.确定了霍乱弧菌中mtl操纵子的转录起始位点，操纵子序列分析显示产毒株和非产毒株启动子聚类形成不同的类别，存在特征性的SNP 位点差异。克隆表达mtlD基因，制备抗体，Western blot检测甘露醇-1-磷酸-脱氢酶在产毒和非产毒株中存在明显差异表达。.自杀质粒介导的同源重组技术和启动子融合报告系统确认产毒株和非产毒株甘露醇PTS操纵子启动子区特异位点上的SNP在甘露醇快慢发酵过程中发挥一定的作用。.细菌的毒力表型与其代谢密切相关，利用表型芯片系统、辅助基础培养基生长试验和定量RT-PCR验证，确定了霍乱弧菌中受cAMP-CRP调控的24种碳原，其中11种碳原的CRP调控现象为首次报导。.首次鉴定并系统研究了三个负责降解霍乱弧菌cGAMP的磷酸二酯酶V-cGAP1/2/3。其特异性的降解3’3’-cGAM为线性产物5’-pApG, 不降解其它构象的cGAMP (2’3’, 2’2’, 3’2’-cGAMP); 受3’3’-cGAMP的强烈诱导表达，促进霍乱弧菌的趋化性，抑制霍乱弧菌在宿主小肠中的定植从而控制其感染宿主的能力，该研究结果填补了基础研究中cGAMP第二信使如何被降解的空白。.TfoX是霍乱弧菌重要的自然感受态调节子，本研究发现cAMP-CRP复合物转录水平激活TfoX，进而促进细胞感受态的形成；并且，cAMP-CRP转录水平调节Tfox的调控机制在包括河弧菌、创伤弧菌、副溶血弧菌、拟态弧菌等在内的弧菌属中是保守的，我们的发现进一步扩展了对弧菌属细菌tfox调控机制的认识。