PTBP1蛋白对Cav1.2钙离子通道选择剪接调控及其在高血压中的作用及机制研究

The function of Cav1.2 calcium channel is optimized by alternative splicing, one of most important post-transcriptional modulation mechanisms, our previous studies indicated that its dysfunction is involved in the genesis and development of several cardiovascular diseases. Recently, we found that the splicing factor PTBP1 was downregulated and Cav1.2 alternative exon 8/8a was also dysregulated in the hypertensive arteries. PTBP1 could directly switch the Cav1.2 alternative exon 8/8a. Moreover, knockdown of PTBP1 desensitized the effects of dihydropyridine on Cav1.2 calcium channel in vascular smooth muscle cells. Therefore, we presume that PTBP1 may make some important roles in the development of hypertension by regulating the Cav1.2 alternative splicing. Thus, we propose 3 specific aims: 1) to elucidate the expressions of exon 8/8a and PTBP1 and their relationship in hypertensive arteries; 2) to study the effects and underlying mechanisms of PTBP1 on the modulation of the Cav1.2 electrophysiological function, vascular myogenic tone and dihydropyridine sensitivity; and 3) to explore whether in-vivo manipulation of PTBP1 will affect the arterial blood pressure. This project will provide a newly potential approach to the management of hypertension.

Cav1.2钙离子通道功能受到选择性剪接这一重要的转录后调节机制的精细调控，我们过去的研究发现这种调节机制的紊乱参与了多种心血管疾病的发生发展。最近，我们发现高血压动脉中剪接调控因子PTBP1的表达降低，同时Cav1.2钙通道剪接外显子exon 8/8a表达紊乱。PTBP1可以直接调控血管平滑肌Cav1.2剪接外显子exon 8/8a的表达。而且，PTBP1敲降后Cav1.2对钙拮抗剂敏感性明显降低。所以，我们推断PTBP1蛋白通过调控剪接事件参与了高血压血管中Cav1.2钙通道的功能调节。为此，我们提出3个研究目标：1）阐明高血压血管中exon 8/8a与PTBP1的表达水平及其相关性；2）阐明PTBP1对Cav1.2电生理特征、血管肌张力和对钙通道拮抗剂的敏感性的影响及机制；3）探究在体操控血管平滑肌内PTBP1表达能否影响动脉血压？这一项目的开展能为高血压的治疗提供一个崭新的策略。

高血压是一种常见的慢性心血管疾病，主要表现为动脉血压升高。Cav1.2钙离子通道激活会引起钙内流，导致血管平滑肌收缩，这对维持血压以及血管肌源性张力起到重要的作用。作为高血压发生的重要机制之一，血管平滑肌中Cav1.2钙通道过度激活会导致血管张力增加，从而引起血压升高。钙离子通道阻断剂，如二氢吡啶类药物，能抑制过度激活的Cav1.2钙通道。因此，它通常被用作一线降压药物。但部分高血压患者对钙通道阻断剂的治疗不敏感，其潜在机制目前仍不清楚。作为一种重要的转录后调节机制，可变剪接能精细调控Cav1.2钙通道的蛋白结构、电生理及药理特性。在神经元发育过程中，剪接调控因子PTBP1可以调控Cav1.2通道外显子8和8a的可变剪接事件，但其对血管Cav1.2通道的功能调控，以及对钙通道阻断剂诱导的血管舒张中的作用都不明了。探索剪接调控因子PTBP1对血管Cav1.2钙通道功能调控作用及机制，研究其对DHP诱导的血管舒张作用的影响，挖掘PTBP1在DHP耐受型高血压中的作用。我们发现，相较于大脑和心肌组织，大鼠肠系膜动脉中PTBP1蛋白表达升高，但含剪接外显子exon 8a的Cav1.2钙通道（Cav1.2E8a）的比例明显降低。与血压正常的WKY大鼠相比，自发性高血压大鼠（SHR）肠系膜动脉中PTBP1表达降低，Cav1.2E8a通道表达升高。值得注意的是，与SHR和人的DHP敏感动脉相比，DHP耐药动脉中PTBP1的表达进一步下调，以及Cav1.2E8a通道增加。在大鼠的血管平滑肌细胞中，将PTBP1的表达敲低，会使得Cav1.2钙通道exon 8转变为exon 8a。利用全细胞膜片钳技术，我们发现，敲降PTBP1会导致Cav1.2E8a通道的增多，导致血管平滑肌细胞Cav1.2钙通道对二氢吡啶药物硝苯地平的敏感性降低。这可能要归因于exon 8/8a在第378位点不同的氨基酸残基。最后，通过血管肌源性张力实验发现在大鼠肠系膜动脉中敲降PTBP1，会使硝苯地平诱导的血管舒张功能减弱。综上所述，我们发现PTBP1通过改变选择性外显子exon 8/8a的表达，精细地调节了Cav1.2钙通道对DHP的敏感性，从而影响DHP诱导的血管舒张效应。因此，我们的工作证明了PTBP1在DHP耐药的动脉中起着关键的作用，并为DHP耐受型高血压的治疗提供了重要的思路。