凡纳滨对虾TRAF3激活IRF机制及抗病毒效应

Interferon (IFN) pathway is one of important antiviral innate immune pathways. It was considered that there were no IFN pathways in invertebrate animals. Our previous research has already illustrated that there is the IFN-like antiviral pathways (IRF-Vago axis) that IRF induces Vago in shrimp, while the mechanism that the upsream factors activate IRF-Vago pathways remains unrevealed. In the study of Litopenaeus vannamei, we predict that TRAF3 is the upstream factor of IRF-mediated antiviral pathways. The project plans to reveal the molecular mechanism of IRF and Vago activation mediated by TRAF3 and explore its antiviral effects based on the following aspects: (1) the molecular mechanism of LvTRAF3-mediated LvIRF activation, (2) the pathways of LvTRAF3-mediated LvVago4 induction, (3) the effect of LvToll1/2/3 on LvTRAF3 activation, (4) the antiviral effect of LvTRAF3. The project links invertebrate Toll pathways and IFN pathways, supports the study on origin and evolution of vertebrate animals interferon pathways, while provides the feasible ideas for the prophylaxis strategies against prawn diseases.

干扰素通路是最重要的先天性抗病毒免疫途径之一，而无脊椎动物一度被认为不具有干扰素通路。我们前期研究工作创新性发现对虾具有IRF调控Vago的类干扰素抗病毒途径，然而其上游分子如何参与调控该途径的分子机制尚不清楚。本项目以凡纳滨对虾为研究对象，通过高通量测序凡纳滨和差异分析，预测TRAF3为IRF-Vago的上游信号分子。本项目以对虾TRAF3为节点开展其调控IRF及Vago激活的分子机制，以及探索性研究上游Toll分子可能对该通路的作用，其内容包括：（1）LvTRAF3调控LvIRF激活的分子机制；（2）LvTRAF3调控类干扰素LvVago4转录表达的机制；（3）LvToll1/2/3对LvTRAF3的激活作用；（4）LvTRAF3抗病毒效应。本项目联通了无脊椎动物Toll通路和干扰素通路，为解析干扰素信号途径的起源与进化奠定重要的基础，也为制定对虾病毒性病害预防策略提供可行的思路。

肿瘤坏死因子受体相关因子（Tumor necrosis factor receptor (TNFR)-associated factors，TRAFs)是先天免疫通路中重要信号传导蛋白，参与调控NF-κB和干扰素调节因子（interferon regulatory factor，IRF)激活的多条免疫通路。在本项目中，我们鉴定并克隆了凡纳滨对虾TRAF3同源蛋白LvTRAF3。LvTRAF3的转录本长3865bp，具有一个1002bp的开放阅读框，能够编码333氨基酸的蛋白质。LvTRAF3具有典型保守的TRAF-C结构域。LvTRAF3在肠道和虾血细胞中的表达水平随着dsRNA模拟物poly（I:C）的刺激和对虾主要病毒性病原白斑综合征病毒（white spot syndrome virus，WSSV）的感染明显提高。利用RNAi的方法，在感染WSSV的对虾体内敲降LvTRAF3能够显著提高WSSV基因的转录，促进WSSV的复制，提高WSSV感染引起的对虾死亡率。接着，本项目发现对虾TRAF3与其他TRAF家族不同，不能通过激活Toll-NF-kB通路调控抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）的表达以激活抗病毒免疫反应。通过双荧光素报告基因实验，LvTRAF3不能激活多个含有NF-κB结合位点的启动子活性，包括WSSV基因（wsv069，wsv056 和 wsv403）、果蝇抗菌肽基因和对虾抗菌肽基因。与双荧光素报告基因实验结果相似，利用RNAi敲降对虾体内的LvTRAF3，并不会影响WSSV感染诱导对虾抗菌肽表达。另一方面，本项目发现LvTRAF3可以调控对虾干扰素通路IRF-Vago抗病毒信号传导。LvTRAF3参与调控LvIRF的激活，从而在WSSV感染过程中调控抗病毒基因LvVago4和LvVago5的表达。综上所述，本项目鉴定克隆对虾TRAF3同源蛋白LvTRAF3，阐明LvTRAF3通过干扰素通路而非NF-κB通路发挥抗病毒功能的分子机制,j揭示TRAF家族蛋白调控抗病毒通路的保守性和进化性。