LpxM和LpxL对副猪嗜血杆菌类脂A分子结构及生物学功能的影响研究

The lipid A molecule is an important toxicity component of Haemophilus parasuis endotoxin, the molecular structure of lipid A is syntheticed by a series of enzymes sequentially. The acyltransferase LpxM and LpxL play a significant role on the molecular structure and biological function of lipid A in related pathogenic bacterias, but the effect of LpxM and LpxL on the molecular structure and biological function of lipid A is unclear in Haemophilus parasuis. Therefore, the acyltransferase LpxM and LpxL genes which synthesized lipid A of Haemophilus parasuis will be inactivated by deletion through homologous recombination method with no antibiotic resistance marker in the project. The lipid A will be extracted in the mutant strains, then identify lipid A molecular structure with thin-layer chromatography (TLC) and mass spectrometry ESI/MS. The lipid A of mutant strains will be inoculated in mice, and the biological function of lipid A will be evaluated by detecting the content of platelet, proinflammatory cytokines and immune factors in mouse blood. The biological characteristics of mutant strains, such as morphology, adhesion, invasion and infection pathogenicity, will be investigated to understand the effect of LpxM and LpxL on the molecular structure and biological function of lipid A in Haemophilus parasuis. Therefore, this study will provide strong data support for pathogenic machanism of Haemophilus parasuis.

类脂A分子是副猪嗜血杆菌内毒素的重要毒性成分，该分子是由多种酶依次相互作用合成的，其中酰基转移酶LpxM和LpxL在其它病原菌中对类脂A的分子结构及生物学功能起着重要的作用，但LpxM和LpxL对副猪嗜血杆菌类脂A的分子结构及生物学功能的影响未知。因此，本项目利用同源重组技术将类脂A分子合成过程中的酰基转移酶LpxM和LpxL基因进行无抗性标记缺失，提取基因缺失菌株的类脂A用薄层色谱法TLC以及ESI/MS质谱技术鉴定其分子结构特征；并将基因缺失菌株的类脂A接种小鼠，通过检测小鼠血液中血小板、促炎因子以及相关免疫因子的含量评价类脂A分子在LpxM和LpxL基因缺失后的生物学功能；同时对LpxM和LpxL基因缺失菌株进行菌体形态、粘附入侵能力以及感染致病力等生物学特性进行鉴定。明确LpxM和LpxL对副猪嗜血杆菌类脂A分子结构和生物学功能的影响，将为副猪嗜血杆菌致病机制的研究奠定基础。

类脂A分子是副猪嗜血杆菌内毒素的重要毒性成分，其中酰基转移酶LpxM和LpxL对类脂A的分子结构及生物学功能起着重要的作用，但副猪嗜血杆菌中LpxM和LpxL对类脂A的分子结构及生物学功能影响未知。因 此，本项目利用同源重组技术将类脂A分子合成过程中的酰基转移酶LpxM和LpxL基因进行无抗性标记缺失，通过筛选和鉴定获得HPSΔLpxM、HPSΔLpxL和HPSΔLpxMΔLpxL菌株。提取各基因缺失菌株的类脂A用薄层色谱法TLC以及ESI/MS质谱技术鉴定其分子结构特征，结果显示各基因缺失菌株的类脂A分子结构发生改变，相应的脂肪酸数量有所降低。并将各基因缺失菌株的类脂A接种小鼠，通过检测小鼠血液中相应细胞因子的含量评价类脂A分子在LpxM和LpxL基因缺失后的生物学功能，结果显示各基因缺失菌株的类脂A毒力明显低于野生型菌株，用基因缺失菌株接种小鼠后所检测的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α促炎因子的含量明显低于野生型菌株。而IL-10、IL-12、γ-干扰素免疫因子的含量与野生型菌株相似。对基因缺失菌株进行生长特性、粘附入侵能力、感染致病力及免疫保护性等生物学特性进行鉴定，结果显示HPSΔlpxM 和HPSΔlpxL菌株与野生型菌株的生长特性相似，HPSΔlpxMΔlpxL菌株比野生型菌株生长慢；HPSΔlpxM、HPSΔlpxL和野生型菌株对PK-15细胞的粘附和入侵能力相似，但HPSΔlpxMΔlpxL菌株对PK-15细胞的粘附和入侵能力减弱；用基因缺失菌株接种小鼠后所检测的IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α促炎因子的含量明显低于野生型菌株，而IL-10、IL-12、γ-干扰素免疫因子的含量与野生型菌株相似， IL-10、IL-12、γ-干扰素免疫因子的含量和野生型菌株相似；HPSΔlpxM、HPSΔLpxL和HPSΔlpxMΔlpxL菌株对猪只的致病性减弱，感染基因缺失菌株的猪血清中IL-1β、IL-6、IL-8、TNF-α等促炎因子转录水平的表达量降低，但猪血清中IL-10、IL-12、γ-干扰素免疫因子的含量和野生型菌株相似， 且基因缺失菌株和野生型菌株的免疫保护性相似。通过该项目的实施阐明了LpxM和LpxL对副猪嗜血杆菌类脂A分子结构及生物学功能的影响，从而为副猪嗜血杆菌致病机制的研究及安全高效疫苗的研制奠定重要基础。