细胞中O-GlcNAc修饰位点的定量蛋白质组分析及作用机制研究

Protein O-GlcNAcylation is a rapid and reversible post-translational modification on Serine/Threonine, playing vital regulatory roles in various cellular processes such as gene transcription, cell growth and degradation, signaling transduction, and stress responses. It has been reported that abnormal O-GlcNAcylation is closely associated with challenging diseases such as cancer, diabetes, and neurodegenerative diseases. However, understanding of the modification sites and functions of O-GlcNAcylation is still quite limited. Here, we propose to develop a sensitive, specific, and high-throughput proteomics method for identification and quantitation of O-GlcNAc modification sites by combining unnatural sugar metabolic labeling, cleavable probe with an isotopic label, and mass spectrometry. Functional studies will be performed for selected O-GlcNAc modification sites in order to decipher their biological roles, and potentially guide drug development of related diseases.

蛋白O-GlcNAc糖基化修饰是存在于蛋白丝氨酸/苏氨酸上的一种动态、可逆的翻译后修饰，在基因转录、细胞生长与降解、信号传导、应激反应等多种生物学过程中发挥重要的调节作用。研究发现，O-GlcNAc修饰水平的异常和癌症、糖尿病、神经退行性疾病等严重危害人类健康的疾病均密切相关。但是目前对于蛋白O-GlcNAc修饰的位点和功能了解依旧比较局限。本项目拟结合非天然糖代谢标记、可切割同位素探针和生物质谱，开发一种高通量、高特异性、灵敏的蛋白质组学新方法，准确定性并精确定量分析细胞中O-GlcNAc的修饰位点，并对差异明显的位点进行功能性研究，对相关疾病的药物研发奠定理论基础。

蛋白的O-GlcNAc修饰是一种重要的蛋白 翻译后修饰，参与机体免疫反应、细胞生长与降解、信号传导、蛋白识别及定位等多种重要的生物学过程，与癌症、糖尿病、神经退行性疾病等严重危害人类健康的疾病均有密切关系。现有的O-GlcNAc修饰鉴定方法特异性不高，且主要集中在修饰位点的定性鉴定上，无法满足大规模定量分析的需求。本项目发展了一项不仅能够在生物样本中准确鉴定O-GlcNAc修饰位点、并且能精确地对O-GlcNAc修饰水平进行大规模定量分析的糖化学生物学技术isoTCL（isotope-tagged cleavable linker）。这项技术结合了非天然糖代谢标记、可裂解分子探针和电子转移解离（ETD）生物质谱，既可应用于代谢标记、也可应用于化学酶标记的O-GlcNAc修饰蛋白质组学分析。采用这项技术分析海拉细胞裂解液中的蛋白O-GlcNAc修饰，共鉴定到来源于404个蛋白的1008个O-GlcNAc修饰位点，其中有很多是文献中从未报导过的新位点。在此基础上我们还考察了不同性别的老鼠胎盘样品的O-GlcNAc修饰。从总体修饰水平来看，后代为雌性的样品O-GlcNAc修饰水平为后代是雄性的样品的1.2倍，且后代为雌性样品中有40%的O-GlcNAc修饰位点比后代为雄性样品中高1.2倍。isoTCL技术能够全面系统性地表征并定量分析细胞中O-GlcNAc修饰位点的动态变化，可以预见将在O-GlcNAc修饰的定量分析中具有广阔的应用前景，对加深其分子机制的理解和相关重大疾病先导药物的研发有极为重要的意义。