细胞内丙烯醛修饰靶点的定量化学蛋白质组分析和功能研究

Acrolein is one of the major reactive carbonyl species (RCS) ubiquitously found in environment such as cigarette smoke, automobile exhaust and kitchen fume. It can covalently adduct to DNA and proteins via electrophilic modification and cause cell death. Its cytotoxicity has been heavily implicated in the pathogenesis of pulmonary diseases including lung cancer. However, the list of cellular targets modified by acrolein still remains elusive to date. This study proposes the development of a novel chemoproteomic method that is able to, not only identify the detailed amino acid sites of action by acrolein in target proteins, but also accurately quantify their extent of modification. Select target sites with high sensitivity toward acrolein modification will be subjected to further functional studies in order to ultimately elucidate the underlying molecular mechanisms on how this cytotoxic electrophile contributes to the pathogenesis of various diseases as well as to inspire development for novel drugs and treatment methods. The proposed chemoproteomic method is generally applicable to quantitatively profile cellular targets by other RCS compounds.

丙烯醛是一种在香烟烟雾、汽车尾气、厨房油烟等外源污染物中广泛存在的亲电活性羰基小分子，可以共价修饰DNA和蛋白质，导致细胞死亡。它的细胞毒性被认为和呼吸道类疾病包括肺癌的发病有很强的关联，但是目前对于丙烯醛在细胞内具体作用靶点的认知还十分有限。本项目计划发展一项以化学分子探针和生物质谱为基础的化学蛋白质组技术，系统地鉴定细胞内被丙烯醛共价修饰的氨基酸位点，精确地定量分析比较其修饰水平，并对高敏感度的修饰靶点开展功能性研究，希望可以从分子水平上解释多种与丙烯醛相关疾病的形成和诱因, 为研发相应的药物和治疗手段提供理论基础。本项目发展的化学蛋白质组技术能够作为一种普适性的工具，用于对细胞内其它活性羰基小分子的作用靶点进行定量鉴定和分析。

在细胞处于氧化应激状态下，细胞膜内的不饱和脂肪酸会发生过氧化反应，产生例如丙烯醛和4-羟基壬烯醛这类的亲电活性羰基小分子代谢物。同时丙烯醛也在广泛存在于香烟烟雾、汽车尾气、厨房油烟等外源污染物中。这类分子可以在蛋白质上产生共价的“羰基化修饰”，影响蛋白质结构和功能，导致细胞死亡。以丙烯醛为例，它的细胞毒性被认为和呼吸道类疾病包括肺癌的发病有很强的关联，但是目前对它在细胞内具体作用的羰基化修饰位点的认知还十分有限。在本项目中，我们发展一系列基于活性捕捉化学分子探针和生物质谱为基础的化学蛋白质组技术，系统地鉴定了细胞内被丙烯醛和4-羟基壬烯醛共价修饰的羰基化修饰位点。首先，我们发展了第一代羰基化生物正交羟胺-炔基探针，并结合基于还原性二甲基化的定量化学蛋白质组学技术，在全细胞蛋白质组中成功地鉴定到超过400个羰基化修饰位点。其次，我们发展了第二代可以高灵敏度捕捉和标记羰基化修饰的苯胺探针，结合定量化学蛋白质组学技术，我们实现对超过1200个4-羟基壬烯醛和500个丙烯醛修饰位点的直接鉴定，并对它们羰基化修饰的敏感度高低进行准确的定量分析。我们还进一步应用苯胺探针，在与氧化应激密切相关的细胞铁死亡过程中鉴定细胞内内源产生的羰基化修饰，发现了465个内源的羰基化蛋白和24个带有4-羟基壬烯醛或丙烯醛修饰的残基位点。我们并对线粒体外膜通道蛋白VDAC2上的第210位半胱氨酸上的羰基化修饰的功能进行了初步的探索。我们的研究为从分子层面上揭示铁死亡以及其它与氧化应激和羰基化修饰相关的疾病的分子机制提供重要的思路和线索。本项目发展的化学蛋白质组技术还作为一种普适性的工具，可以拓展用于对细胞内其它翻译后修饰、生物活性分子和药物的作用靶标蛋白和位点进行定量鉴定和分析。