RNA表观遗传新机制调控DNA双链断裂修复分子机理研究

DNA double-strand break (DSB) is the most lethal DNA damage lesion. Even if one left unrepaired, it is sufficient to cause cytotoxicity and genomic instability, and ultimately causes cancer or promotes premature aging. Mutations in DNA repair genes often lead to the development of malignant disease syndromes. The discovery of new components of DNA DSB repair and its novel regulatory mechanisms have been always in the hotspots of this research field, increasing our understanding of tumorigenesis. In our pioneering studies, we identified two novel RNA epigenetic mechanisms, including RNA methylation N6-methyl-adenosine (m6A) and a unique DNA DSB-induced non-coding small RNA (named diRNA), are closely related to the repair of DNA DSBs. By integrating molecular, cellular, biochemical, genomic and bioinformatics approaches, we aim to elucidate molecular mechanisms how the two new RNA epigenetic mechanisms regulate DNA DSB repair, how they modulate enzymatic activities, cellular locations and recruitments to DNA DSB sites, differential gene expression and alternative mRNA splicing of key DNA DSB repair factors. We also determine to clarify the physiological and pathological effects of this regulatory network consisting of RNA epigenetics and DNA DSB repair, and its association with tumor malignancy, and eventually to provide new ideas for the diagnosis and treatment of genomic instability induced diseases and the development of personalized medicine.

DNA双链断裂是最致命的DNA损伤形式，即使单个没有得到正确修复的DNA双链断裂就足以导致细胞毒性和基因组不稳定，最终引起癌症和促进过早老化。DNA修复基因突变常导致易患恶性肿瘤的疾病综合征。DNA双链断裂修复新组分和其调控新机制的发现一直是该领域的研究前沿热点，推动了肿瘤发生机制研究。在前期研究中我们发现两种新的RNA表观遗传机制包括RNA甲基化 6-甲基腺嘌呤（m6A）修饰和一种由DNA双链断裂诱导产生的特殊非编码RNA-diRNA，均与DNA损伤修复紧密关联。本课题将整合分子、细胞、生化、基因组和生物信息学等技术体系，阐明上述RNA表观遗传调控DNA双链断裂修复作用机制、修复蛋白的活性和定位、基因表达差异及mRNA选择性剪接规律，并阐明RNA表观遗传-DNA双链断裂修复调控网络的关键因子的生理病理效应及与恶性肿瘤关联性，为与基因组不稳定性诱发的疾病和个体化医疗诊治提供新的思路。

首先利用生化和细胞生物学等手段，发现diRNA只调控DSB的同源重组修复途径，而不影响非同源末端连接修复途径。这种特异性修复活性依赖于diRNA的效应蛋白Ago2。Ago2可与同源重组修复重要因子Rad51形成复合物，并且Rad51在DSB位点的招募和同源重组修复活性取决于Ago2的催化活性及其结合小RNA的能力。这些研究结果表明，Ago2可能在diRNA的指导下，促进Rad51在DNA双链断裂位点的招募或滞留，从而调控同源重组活性，高效修复DNA损伤。研究进一步揭示了小RNA在DNA双链断裂修复过程中的保守性和重要功能，为后续从小RNA和DNA修复角度开展对人类疾病如恶性肿瘤发生发展研究提供了新思路。.本研究同时揭示了RNA m6A甲基化位点选择性机制的具体机制。利用生化、干细胞、基因组学、生物信息学等多层次技术手段，合作团队发现m6A修饰和非编码microRNA 在共同作用底物mRNA上的位点具有物理空间相关性：部分反向匹配潜在m6A修饰RRACH序列的非编码microRNA能够介导其结合的mRNA RRACH位点m6A甲基化；另一部分不反向匹配潜在m6A修饰RRACH序列的非编码microRNA能够介导结合的mRNA位点附近的RRACH序列被甲基化。在人和小鼠细胞中，过表达microRNA或其加工酶Dicer，可以显著增加mRNA m6A修饰水平，而敲低两者之一则导致m6A修饰水平下降。Dicer可以调控m6A甲基转移酶催化亚基METTL3在细胞核内核小斑的定位。Dicer和microRNA均可以调控METTL3结合mRNA的亲和力。过表达野生型microRNA可导致结合的mRNA甲基化位点m6A修饰水平升高，而突变体microRNA结合的新的mRNA位点原来为非甲基化位点则可以检测到高m6A修饰水平。Dicer和microRNA的表达水平变化并不会影响m6A修饰的甲基转移酶METTL3和去甲基化酶ALKBH5和FTO的蛋白表达水平，说明了非编码microRNA能够调控RNA m6A甲基转移酶选择底物mRNA的甲基化位点。通过该工作揭示了非编码microRNA调控RNA m6A甲基转移酶选择底物mRNA的甲基化位点机制和RNA m6A修饰调控细胞重编程重要功能。