丙酮酸循环介导抗生素入胞机制的研究

Antibiotic-resistant bacteria severely impairs sustainable development of aquaculture in China, which not only causes huge economic loss but also threaten human health and food safety. Therefore, the national government calls for reducing the use of antibiotics in farming industry. In recent years, we show that exogenous metabolites alanine, glutamate and glucose could revert antibiotic resistance via a newly defined metabolic cycle, the pyruvate cycle, which increases the uptake of antibiotics (Cell Metabolism, 2015; PNAS, 2018). However, how pyruvate cycle regulates the porins that allows the entry of the antibiotics remains poorly understood. This proposal is thus to address this issue by screening transposon-insertion mutagenesis library to identify key genes for metabolite-enabled killing, investigating how metabolites regulate the pyruvate cycle-two component system-porins axis, and exploring the effect of downstream metabolic pathways like purine metabolism and pyrimidine metabolism in regulating antibiotic entry. We believe this research would not only elucidate the mechanism by which how metabolism regulates antibiotic uptake but also develop a metabolism-based approach to control antibiotic-resistant bacteria, which set up the basis for potential clinic application.

耐药菌严重危害我国水产养殖业，不仅造成巨大的经济损失，而且危害人体健康和食品安全，因此减量增效使用抗生素已成为国家的重大需求。申请者发现，丙氨酸、谷氨酸和葡萄糖可以通过申请人新近发现的丙酮酸循环，逆转细菌耐药性，促进耐药菌对抗生素的高效摄取，实现减量增效（Cell Metabolism，2015； PNAS, 2018）。然而，其如何调节外膜通道蛋白质使抗生素进入胞内这一关键机制尚不清楚，影响其应用。本研究拟继续以迟缓爱德华菌为对象，通过筛选全基因组突变库，发现与丙氨酸、谷氨酸和葡萄糖促进卡那霉素高效杀菌的相关全部基因；深入系统地研究这些代谢物通过丙氨酸循环-双组份系统-外膜抗生素通道蛋白这一调节途径的作用机制；揭示丙氨酸循环下游代谢通路如嘌呤和嘧啶生物合成等在其中的作用。旨在揭示代谢调节促进耐药菌对抗生素摄取的分子机制，建立一种利用代谢调节有效控制耐药性的新策略并促进其临床应用。

抗生素耐药细菌往往具有较低的膜通透性，导致抗生素无法有效穿透细菌膜屏障进入胞内发挥杀菌作用，这也是目前耐药菌难以克服的重大挑战之一。我们基于此前发现通过对耐药菌的代谢组重编，可以增加膜通透性，将细菌从“拒绝”抗生素的状态转变为“接受”抗生素的状态，提高胞内抗生素的浓度，杀死耐药菌。并发现了一个全新的代谢循环，丙酮酸循环（P循环），可以调节抗生素的进入，但机制不清。在本研究中，我们以严重危害水产养殖的重要病原菌，迟缓爱德华菌，和氨基糖苷类抗生素为研究对象，揭示了P循环在调节抗生素杀菌方面的多样性，表现在不仅能促进抗生素的进入也能促进抗生素发挥杀菌作用。通过转座子插入突变库的筛选，发现了多个和P循环相关基因被引入插入突变后会降低对葡萄糖和庆大霉素敏感性，并在此基础上将P循环的所有基因一一敲除，构建单基因缺失菌株。从中筛选到了gltA这一关键基因和其上游代谢物丙酮酸。gltA缺失菌会让代谢物协同抗生素的杀菌效果基本失效，且极大降低胞内抗生素浓度。进一步研究表明gltA会导致代谢流向泛酸和辅酶A的生物合成通路，而泛酸及其形成的中间产物天冬氨酸会行使抑制抗生素的杀菌效果。而丙酮酸则能提高抗生素的杀菌效率，其原因在于一方面促进了潜在膜通道蛋白OmpA、FadL和NhaB的表达。另一方面，提高了由乙酰辅酶A介导的全局乙酰化水平，辅助了抗生素的进入。这些结果说明了细菌可以通过gltA调节代谢流入P循环还是流入泛酸和辅酶A合成通路来达到调节抗生素的杀菌作用。同时，P循环可以促进甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢通路来间接调节抗生素的进入，也可以促进ROS的生成，放大氨基糖苷类抗生素的杀菌效果。由此，我们这一研究揭示了P循环从多个角度调控抗生素的杀菌作用，不仅解析了此前发现的谷氨酸、丙氨酸和葡萄糖促进抗生素进入的机制，也从中发现了苏氨酸等新的可以促进抗生素杀菌作用的分子，并对不同氨基酸分子的协同杀菌作用做了初步尝试，为开发可广泛适用于水产养殖行业的抗生素增效剂提供了基础。