铋材料导致肾细胞自噬及入胞机制的研究

Bismuth compounds are popular medicines for gastrointestinal diseases, while bismuth nanomaterials have been widely applied in cosmetic industry and recently emphasized in the tumor imaging and therapeutics. However, bismuth presents mild toxicity, while there is a lack of mechanistic studies as well as their safety evaluation methods. We plan to synthesize bismuth nanomaterials and compare them with bismuth compounds and bismuth ion regarding to bismuth accumulation in the kidney and nephrotoxicity. Bismuth nanomaterials will be also modified with active polysaccharide, aiming to increase its safety and immunoactivity. In addition, there are very few studies for intracellular accumulation and cellular uptake mechanisms of bismuth in the nephritic cells, the endocytic pathways and transporter/receptor for bismuth will be investigated through the use of high content imaging system, aiming to differentiate the cellular uptake mechanisms between bismuth sources. Finally, our preliminary studies indicated that some bismuth sources can induce autophagy in nephritic cells, based on which the autophagy associated signal pathways induced by bismuth will be delineated and a dual fluorescence labeling system for autophagy will be made for the early response evaluation of bismuth materials. Through the comparative studies for the nephrotoxicity, endocytosis and autophagy induced by different bismuth materials, we hope the role of autophagy during bismuth induced nephrotoxicity can be fully elucidated, and the establishment of autophagy associated early responsive detection method could be applied for in vitro safety evaluation for bismuth materials.

铋剂是肠胃病治疗的常用药，而铋纳米材料在化妆品行业有广泛应用，并近年来在肿瘤影像与治疗研究方面有突出表现。然而铋有一定肾毒性，目前机制并不清楚，且缺乏安全性评价方法。申请人拟合成铋纳米材料，同时与铋剂、铋离子比较，研究它们的肾累积及毒性的差异，并通过活性多糖修饰铋纳米材料，以增加其安全性和免疫活性。另外，铋在肾细胞中累积与入胞机制尚无报道，申请人将结合高内涵系成像系统，分析铋的入胞途径，探索铋相关的内吞受体及转运体，并比较不同铋材料胞吞的差异。最后，本课题组首次发现铋纳米材料与铋离子可导致肾细胞自噬，在此基础上我们将研究铋在体内外导致自噬的过程，详细描述自噬发生的信号传导通路，并利用自噬双荧光标记系统研究多种铋材料导致自噬的早期应激反应。通过对不同铋材料肾毒性、入胞与自噬机制的研究及比较，申请人希望能系统阐述铋的肾毒性及自噬在其中的角色，并利用自噬检测平台建立合适的铋材料体外安全评价系统。

铋纳米材料被广泛地应用于冶金业、化妆品工业以及医疗诊断中，与铋相关的化合物也常被用于治疗细菌感染引发的胃肠道疾病。由于有研究表明铋相关化合物对人体健康具有副作用，特别是对肾脏器官，我们研究了铋纳米颗粒（BiNP）以及铋化合物的肾毒性及其机制。我们制备了BiNP，证明其能够增加肿瘤的成像效果，但BiNP对人胚胎肾细胞的毒性相比于其它细胞尤其明显；通过荧光标记发现进入细胞存在明显的浓度和时间依赖性；透射电子显微镜和能量色散X射线分析表明，BiNP存在于细胞质并且最终到达溶酶体中。小鼠体内实验表明BiNP对肾脏有损伤，包括了肌酐和血尿氮增加，以及小鼠的近曲小管中能够观察到有调亡和坏死的细胞存在，其引起的急性肾损伤与自噬相关。BiNP使自噬标记蛋白LC3II增加，但是与自噬流相关的p62蛋白没有明显变化；体外试验证明有自噬囊泡的形成并伴随着自噬相关蛋白包括Beclin1、Atg12等的增加；结果显示BiNP引发的肾细胞损伤由于雷帕霉素诱导发生自噬而得到缓解，而氯喹的自噬阻碍使得肾损伤变的更加严重；我们还发现BiNP引起的活性氧的产生是自噬发生的主要诱导物之一；最后，BiNP引发的自噬信号主要是通过AMPK/mTOR信号途径，部分通过Akt/mTOR途径。我们研究了铋离子的入胞机制，发现枸橼酸铋钾的内吞更依赖于ATP的协助、网格蛋白介导的内吞作用、高尔基体的存在以及内涵体的形成，但硝酸铋不依赖上述途径；另外，镉转运体TRPV6和MRP多药耐药性蛋白起到了铋离子转运的作用，并且入胞转运明显与谷胱甘肽GSH的生成有关。我们在BiNP修饰上了灵芝多糖获得GLP-BiNP。体外研究中，GLP-BiNP可进一步促进DC成熟，表现成熟表型标志物、细胞因子的释放、酸性磷酸酶活性的增加和T细胞增殖；在体内研究中，GLP的修饰减轻了BiNP的肾毒性，改变了铋元素在主要组织器官中的分布并且在肿瘤组织中能快速积累，成熟的DC也在在24h内于脾脏、肿瘤中显著增加，与放射治疗能通过显著抑制肿瘤生长及肺转移，并有效地增加肿瘤微环境中CD8+T细胞数量，改善免疫平衡状态。