基于毛细管电泳技术对抗菌肽与活菌结合机制的探索及抗菌肽的快速筛选

Antimicrobial peptides (AMPs) with bioactivities have broad application prospects in the field of food preservatives. Now the antimicrobial mechanism is explored under the condition of model membranes without the bioactivities and micro-environment of living bacteria , which can not accurately explain the mechanism of AMPs binding to living bacteria.Consequently, how to characterize the mechanism of AMPs binding to living bacteria is the key step to explore the antimicrobial mechanism.The living bacteria (Escherichia coli, Staphylococcus aureus, Fungi and Yeasts) suspensions in the running buffer are used as a pseudo-stationary phase to characterize the binding processes of AMPs to living bacteria based on capillary electrophoresis. In order to establish the model and explore the antimicrobial mechanism,the method of capillary coating, electrophoresis conditions, and characteristics of AMPs binding to living bacteria will be studied deeply.Furthermore, this model will be applied to rapid screening of AMPs based on the affinity between AMPs and living bacteria. The project will not only explore the mechanism of AMPs binding to living bacteria, but also supply a novel screening method of AMPs.

抗菌肽是一类肽类活性物质，在天然食品防腐剂方面有着广阔的应用前景。目前抗菌肽抗菌机制的研究是在模拟生物膜的条件下进行，但模拟生物膜不具备菌膜生物活性的"微环境"，无法准确模拟抗菌肽与菌体的相互作用。由于抗菌肽的抗菌过程发生在活菌环境下，因此，如何能在活菌条件下探索抗菌肽与菌膜的结合机制是抗菌肽抗菌机理研究的关键。本项目采用毛细管电泳技术，将4种常见污染菌（大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、霉菌和酵母菌）的活菌体添加到电泳缓冲液中作为"假固定相"，通过系统研究毛细管涂层方法、电泳条件等，建立抗菌肽与活菌结合的毛细管电泳模型，通过表征结合常数等参数，探索结合机制；并进一步利用该模型中抗菌肽与菌体存在的特殊亲和力快速筛选抗菌肽。本项目研究不仅能实现在活菌条件下抗菌肽与菌膜结合机制的探索，而且还能同时为快速筛选抗菌肽提供一条新的途径。

抗菌肽是一类肽类活性物质，在天然食品防腐剂方面有着广阔的应用前景。目前抗菌肽抗菌机制的研究是在模拟生物膜的条件下进行，但模拟生物膜不具备菌膜生物活性的"微环境"，无法准确模拟抗菌肽与菌体的相互作用。由于抗菌肽的抗菌过程发生在活菌环境下，因此，如何能在活菌条件下探索抗菌肽与菌膜的结合机制是抗菌肽抗菌机理研究的关键。本项目采用毛细管电泳技术，将活性金黄色葡萄球菌（LSACs）添加到电泳缓冲液中作为"假固定相"，通过系统研究毛细管涂层方法、电泳条件等，建立抗菌肽与活菌结合的毛细管电泳模型，通过表征结合常数等参数，探索结合机制；并进一步利用该模型中抗菌肽与菌体存在的特殊亲和力快速筛选抗菌肽。具体重要研究结果如下：（1）以1mol/L NaOH 为预处理试剂，以控制电渗流的大小为指标，在预处理温度40℃和时间40min下，及以4%聚乙二醇的修饰下，毛细管柱在pH（3-10）出现了良好的稳定性。（2）将LSACs作为“假固定相”，依据毛细管电动色谱原理，用相对淌度代替淌度，实现了探索活性菌体对抗菌肽（Lys-Val-Phe-leu-Gly-leu-Lys，P1； Cys-Ala-Ile-Leu-Thr-His-Lys-Arg，P2）的迁移行为的影响。抗菌肽P1和P2与LSACs之间的结合过程是自发进行的，而且结合效果均很显著。随着温度的增加，2种抗菌肽与LSACs的结合常数也随着增大。其中P1以疏水相互作用力为主要作用，而P2则以静电吸引力和疏水相互作用为主要作用。（3）在活菌体环境下，抗菌肽P1和P2能快速结合到菌细胞壁上，并对细胞壁造成损伤，进而扩散到细胞膜。当抗菌肽浓度在细胞膜上超过一定的阈值，就会破坏细胞膜的完整性，使得胞内物质泄漏，导致菌体死亡。其中P1是以“毯式”模式的膜损伤抗菌特征，而P2是以“桶状”模式的膜损伤抗菌特征。（4）利用抗菌肽与菌体存在的特殊亲和力，成功地从草鱼蛋白水解物中纯化出一个抗菌肽，其序列为Lys-Arg-Lys-Lys-Leu-Thr-His，其不仅改善了食品体系氨基酸组成还延长了保质期。该项目的研究结果不仅能实现活菌条件下抗菌肽与菌膜结合机制的探索，而且为快速筛选天然食品防腐剂抗菌肽提供一条新的途径。