基于肿瘤与微环境的交叉对话研究扶正抗癌方逆转EMT的分子机制

The metastasis of NSCLC cells is the main reason leading to the treatment failed and patient death, which is affected by the crosstalk between tumor and its microenvironment significantly. The previous studies showed the tumor-associated macrophages(TAMs) intervened in the process of Fuzheng Kang-ai decoction(FZKA) inhibiting the epithelial–mesenchymal transition(EMT) and tumor metastasis. Simultaneously, FZKA could also affect the expression of exosomes miRNA derived from TAMs, and induce TAMs to M1 type. Accordingly, we speculated that FZKA can inhibit tumor metastasis by affecting the cross-talk between tumor and TAMs. To further explore the mechanism, a NSCLC metastatic model in nude mice will build to explore the influence by FZKA on tumor metastasis, TAMs type and the miRNA expression in TAMs exosomes. The A549 cells, RAW264.7 macrophages induced by IL-4 and TAMs from nude mice will be the research objects in vitro experiments. And, the exosomes extraction and purification, flow cytometry, qPCR, westernblot and RNA interference will be used to study whether FZKA could inhibit tumor metastasis through “Promoting TAMs to M1 type- intervening in TAMs exosomes- upregulating miR-429 expression- inhibiting ZEB1 activation- reversing EMT”. Thus the study will provide new ideas for anti-tumor research of TCM.

肿瘤发生浸润转移是NSCLC患者治疗失败死亡的主因，而肿瘤与微环境间交叉对话在肿瘤转移中有重要作用。前期发现，TAMs干预了扶正抗癌方抑制EMT及肿瘤转移的进程；同时，扶正抗癌方影响TAMs来源外泌体中miRNA的表达，并诱导TAMs向M1型极化，推测扶正抗癌方通过影响肿瘤和TAMs之间的交叉对话影响肿瘤转移。为进一步探明机制，本研究计划建立裸鼠NSCLC转移模型，体内探究扶正抗癌方对转移、TAMs极化以及TAMs来源外泌体中miRNA表达的影响；体外实验以A549细胞、IL-4诱导RAW264.7巨噬细胞及裸鼠肿瘤组织来源TAMs为对象，采用外泌体提取与纯化、qPCR、免疫印迹、RNA干扰等技术研究扶正抗癌方能否通过“促进TAMs向M1型极化-干预TAMs来源外泌体-上调外泌体中miR-429表达-靶向抑制ZEB1激活-逆转EMT”方式抑制细胞转移，从而为中医药抗肿瘤研究提供新的思路。

肿瘤发生浸润转移是NSCLC患者治疗失败的主要原因，肿瘤与微环境的交叉对话在肿瘤转移中起重要作用。我们前期临床研究发现扶正抗癌方能延长病人的生存期，使病人获得长期生存获益。本课题主要研究扶正抗癌方抑制NSCLC转移的机制。首先，划痕和transwell实验发现扶正抗癌方不仅抑制A549细胞在内的多种肺癌细胞转移，更提示肿瘤相关巨噬细胞（TAMs）来源的外泌体干预了这一过程；体内通过小鼠活体成像技术，以裸鼠皮下移植瘤和尾静脉注射构建裸鼠转移瘤为模型，发现扶正抗癌方在A549组缩小皮下转移瘤的体积、重量、荧光强度，减少肺部转移瘤的数目，A549+TAMs组其皮下转移瘤的体积、重量、荧光强度更低、肺部转移瘤数目更少，再次验证扶正抗癌方通过逆转TAMs表型进而抑制非小细胞肺癌的转移。其次，通过QPCR、蛋白质印迹法、流式细胞术等技术进一步研究其机制；极化方面：扶正抗癌方通过在基因和蛋白质水平上调M1型巨噬细胞标志物iNOS，下调M2型巨噬细胞标志物CD206、IL-6、TGF-β的表达而逆转TAMs极化，其机制是通过扶正抗癌方上调miR155的表达，进而靶向抑制C/EBP-β表达来实现的。转移方面，扶正抗癌方通过下调间质细胞的标志物Vimentin和N-Cadherin蛋白的表达，上调上皮组织的标志物E-Cadherin蛋白的表达而逆转EMT，其机制一方面是扶正抗癌方通过下调TAMs来源外泌体中miR-21-5p靶向PTEN，进而抑制EMT进程；另一方面扶正抗癌方通过上调miR-200b-3p的表达，靶向抑制ZEB1，进而抑制EMT进程。最后，以蛋白质印迹法在体内裸鼠瘤体组织中再次验证扶正抗癌方通过逆转TAMs极化进而抑制EMT。此外，发现扶正抗癌方通过miR221-3p/p27Kip1阻滞细胞周期，发现扶正抗癌方中的主要单体成分澳洲茄碱通过下调ZEB1、Snail、Slug的表达进而逆转EMT进程，同时阐明了其抑制凋亡的机制；另外的单体成分重楼皂苷I通过p65调控下游MMP-2、MMP-9的表达进一步抑制转移。综上所述，该课题阐明了扶正抗癌方通过外泌体途径抑制NSCLC转移的机制，对于筛选扶正抗癌方的优势人群，在基因层面上指导中医的个体化治疗具有重要意义。