阿拉伯木聚糖导致酵母提前絮凝的分子特征及作用机制

The abnormal premature yeast flocculation that happens during brewing would cause serious problems in the production process and negatively affect quality of final beer product. Previous studies have proposed arabinoxylan with special structures as the key premature yeast flocculation factor. However, the molecular feature and action mechanism is still unillustrated. In this study, arabinoxylan with flocculation activity will be prepared with affinity chromatography using recombinant Lg-Flo1p as affinity ligand. Furthermore, the recognition and binding site of arabinoxylan to yeast flocculation protein will be identified, by structure feature comparing of arabinoxylans that present variable flocculation activities. Moreover, the effect of ferulic acid on the premature yeast flocculation will be demonstrated. And the molecular mechanism of arabinoxylan inducing premature yeast flocculation will be thoroughly understood with the aid of surface plasmon resonance technique and thermodynamic adsorption model and kinetic adsorption model. The study will provide important theoretical basis for the structure-activity relationship research of polysaccharides, and great significance to the brewing science and practice.

酵母提前絮凝严重影响啤酒的生产效率和品质，阿拉伯木聚糖是导致酵母提前絮凝的关键物质，但其导致酵母提前絮凝的分子特征及作用机制尚不清晰。本课题通过外源表达酵母絮凝蛋白，将其作为亲和吸附剂，分离获得高絮凝活性的阿拉伯木聚糖；比较分析不同絮凝活性阿拉伯木聚糖的分子结构差异，结合特异性酶切后絮凝活性的变化、单糖苷与絮凝蛋白的亲和能力差异，确定阿拉伯木聚糖与酵母絮凝蛋白的结合位点；研究阿魏酸酯化对阿拉伯木聚糖结合位点与酵母絮凝蛋白结合能力的影响，结合生物信息学技术明确阿魏酸残基的作用机制；通过基于表面等离子共振技术比较阿拉伯木聚糖、酵母细胞壁甘露聚糖与絮凝蛋白的结合阻力，结合建立阿拉伯木聚糖与酵母絮凝蛋白的动力学和热力学吸附模型，确定阿拉伯木聚糖导致酵母提前絮凝的作用机制。本课题探索阿拉伯木聚糖导致酵母提前絮凝的分子特征及作用机制，对多糖的构效关系研究和啤酒酿造科学理论与技术的进步具有重要的价值。

酵母提前絮凝严重影响啤酒的生产效率和品质，阿拉伯木聚糖是导致酵母提前絮凝的关键物质，但其导致酵母提前絮凝的分子特征及作用机制尚不清晰。本课题基于酵母絮凝理论，实现了絮凝蛋白N端在大肠杆菌 的外源表达，发现N-Lg-Flo1蛋白存在与甘露糖和阿拉伯糖的结合位点，制备的以N-Lg-Flo1p为配基的亲和吸附剂可以用于制备高絮凝活性的阿拉伯木聚糖；通过荧光光谱测定N-Lg-Flo1蛋白与甘露糖和阿拉伯糖的结合活性，结果表明N-Lg-Flo1蛋白存在与甘露糖和阿拉伯糖的结合位点，结合部位的氨基酸可能为Trp、Phe或Tyr。分子对接模拟表明N-Lg-Flo1蛋白与甘露糖结合位点为196位的Trp，而与阿拉伯糖相互作用的氨基酸残基为Tyr44和Lys69。乙醇分级沉淀表明麦汁多糖的PYF活性与阿拉伯木聚糖的比例成正相关，高或低分子量的阿拉伯木聚糖都能导致PYF，表明只有符合一定结构特征的阿拉伯木聚糖分子才是影响PYF活性的主要因素，而阿拉伯木聚糖的主要侧链基团阿拉伯糖或阿魏酸酯化的阿拉伯糖是潜在的活性中心。采用阿魏酸酯酶特异性水解阿拉伯木聚糖侧链上的阿魏酸残基，削弱了阿拉伯木聚糖与酵母絮凝蛋白的结合，多糖桥作用力减弱，PYF活性降低，表明结合态阿魏酸是PYF因子的一个重要组成部分。通过RT-qPCR测定阿拉伯木聚糖对不同发酵时间酵母絮凝蛋白表达量的影响，结果表明PYF现象的产生不是絮凝蛋白的过量表达导致的，可能是其它分子间作用力导致的。随着发酵时间的延长，酵母的Zeta电位降低（负电荷减少），表明PYF因子能结合到酵母细胞表面，使Zeta电位增大，表明带负电荷的PYF因子与多个带负电荷的酵母细胞通过Ca2+桥连接，引起酵母提前絮凝。本课题探索阿拉伯木聚糖导致酵母提前絮凝的分子特征及作用机制，对多糖的构效关系研究和啤酒酿造科学理论与技术的进步具有重要的价值。