小麦麸皮阿拉伯木聚糖免疫调节的活性位点及作用机制研究

Arabinoxylan (AX) is abundant in agricultural by-products of wheat bran, which possess numerous biological activities. However, the mechanisms of immune regulation and the active site(s) are largely unknown. The applicant found that the wheat bran AX isolated from a local wheat cultivar Huaimai 33 consists of three fractions (AX-1, AX-2, AX-3) and all of fractions have the immunomodulating properties. Among these three fractions, AX-2 is the best, and it can enhance the secretion of secretory IgA (SIgA) in immunosuppressive mice. Apart from that, it also can induce pro-inflammatory cytokine in mouse peritoneal macrophages. Hence, we aim to analysis the structure of AX-2 systematically and find the active sites that have immunomodulating ability. Here, we use biofilm interferometry and confocal laser technology to study the association and dissociation effect between AX-2 and TLR4. And we study the function of TLR4 and NF-kB signaling pathway in AX-2 immune regulation by using mouse peritoneal macrophages isolated from wild type C3H/HeN and mutant C3H/HeJ mice as experimental models. To sum up, this project will reveal the active sites and the immune regulation effect of AX-2 from molecular level. Moreover, it will be of great benefits to further research the mechanisms of biological functions of AX and provide a significant theoretical basis for further development and utilization of wheat bran as well.

小麦麸皮中阿拉伯木聚糖 (Arabinoxylan，AX) 含量丰富，具有众多生物活性，但目前对AX免疫调节活性位点及作用机制还不清楚。申请者前期研究发现“淮麦33”麸皮中的AX三个级分（AX-1、AX-2、AX-3）具有免疫调节活性，其中AX-2免疫调节活性最佳，且AX-2能够增强免疫低下小鼠的肠黏膜免疫效应因子SIgA的分泌，并能促进巨噬细胞分泌促炎因子。本项目拟系统解析AX-2的结构及具有免疫调节作用的活性位点；运用生物膜干涉和激光共聚焦技术研究AX-2与TLR4的结合及解离效应；以TLR4野生型和突变型小鼠腹腔巨噬细胞为模型，研究TLR4/NF-kB信号通路在AX-2免疫调节过程中的作用。项目将从分子水平揭示AX-2活性位点及对免疫细胞信号通路的调节作用，有助于拓展研究AX生物学功能的发生机制，为麸皮资源综合利用提供一定的理论依据。

小麦是世界上最早也是种植最广泛的粮食作物，产量仅次于玉米。小麦麸皮阿拉伯木聚糖具有降血糖、降低血清胆固醇、预防便秘、调节血糖水平及免疫调节的生理功能，但关于阿拉伯木聚糖（Arabinoxylans，AX）在细胞分子水平的免疫调节作用及机制鲜有报道。本研究以小麦麸皮（淮麦33）为实验材料，研究不同提取方法对小麦麸皮多糖提取率、提取后数皮残渣微观形态、糖醛酸含量、硫酸根含量、蛋白质含量、单糖组成及免疫调节活性的影响；通过体外实验和体外实验研究小麦麸皮多糖的免疫调节作用；研究纯化小麦麸皮多糖结构与其活性之间的关系，转录组分析AX免疫调节的分子机制；体外发酵实验研究AX对肠道菌群结构的影响。不同提取方法提取的小麦麸皮多糖均由阿拉伯糖、木聚糖及葡萄糖组成，均无细胞毒性，其中水提法获得的多糖能显著促进RAW264.7细胞分泌NO因子并能促进细胞iNOS和COX-2蛋白的表达，且通过调节NF-κB、AP-1、p38 MAPK信号转导通路促进巨噬细胞的免疫功能。小麦麸皮多糖能够增强环磷酰胺所致免疫低下小鼠的胸腺和脾脏器官指数，并上调细胞因子的分泌水平。小麦麸皮水溶性多糖经分离纯化后得到3个组分均由阿拉伯糖和木糖组成，系统解析了阿拉伯木聚糖的功效关系。转录组分析发现，差异基因主要富集于一系列免疫相关过程，包括NF-κB信号通路和TNF信号通路。RT-qPCR分析了16个富集于炎症相关通路的DEGs，发现炎症因子的mRNA水平在AX处理组显著上调。此外，AX处理可诱导NF-κB p65的核转位及其上调其上游蛋白PDK1、Akt、IκB-α和GSK-3β的表达。通过体外发酵实验发现肠道菌群可以利用AX产生短链脂肪酸，降低发酵液pH值，增加双歧杆菌等益生菌的丰度，调节肠道菌群结构。本研究有助于从分子水平上阐明AX对免疫细胞信号转导途径的调节作用，对提高小麦加工副产物综合利用水平，改善民众健康平衡饮食结构具有重要的意义。