结合态有机铁转化微生物的筛选及有机铁形成机理的研究

In our country, Iron deficiency is the most common nutritional diseases. With low toxicity and high absorption and utilization characteristics, the organically bound form of iron could be obtained by using microbial transformation, which is an important direction of research for study on organic iron supplements. In recent years, Although Saccharomyces cerevisiae was used to transform and obtain bound iron, there are still many problems that its microbial transformation conversion was low and the genetic of iron enriched strain was instability. As a result, we screened the very small range of mine in Gansu province and obtained higher transformed strain resistant iron capacity of more than 15 times of the wild-type Saccharomyces cerevisiae. Accordingly, Based on this excited result, in the present research, Microbiology and modern Nutrition will be applied to find better the iron-rich microbial resources and resistance to higher iron transformed strains from wide range of natural environment through the iron conversion rate, comparison of organic iron content. Following, the bound organic iron will be separated and prepared to evaluate their nutritional activity after fermentation. With modern molecular biology techniques and bioinformatics, we will separate and analysis the siderophores secreted by interesting strain, clone and express iron absorption transporter related genes, analysis the organic iron content and the state in interesting strain; finally, transformation, absorption, storage of the mechanism in the high iron transformed strains will be found. This study will provide new ideas and innovation platform for iron and zinc, selenium and other combined state organic trace element supplements and additives. This project would be broad prospects and promising research.

铁缺乏症是我国最常见的营养性疾病。通过微生物转化可获得结合态的有机铁，它具有低毒和高吸收利用率的特性，是有机铁补充剂研究的重要方向。现有的利用酿酒酵母富集转化无机铁的研究中，存在转化无机微量元素低，且遗传不稳定等问题。因此，本研究基于通过前期小范围筛选，并已经获得耐铁能力超过，野生型酿酒酵母15倍的高富集转化菌株的基础上，拟采用微生物学和现代营养学的方法，通过铁转化率、有机铁含量的比较，筛选以获得自然环境中更好的富铁微生物资源和耐高铁转化菌株。发酵后分离制备结合态有机铁，并就其营养活性进行评价。通过采用现代分子生物学技术并结合生物信息学的方法，分离、分析其铁载体，克隆并表达铁吸收、转运的相关基因，分析有机铁在菌体的存在状态，获得高铁环境中有机铁转化菌株，转化、吸收、存储的机理。本研究将为铁以及其他锌、硒等结合态有机微量元素补充剂和添加剂的研究，提供思路和创新平台，是具有广阔前景的研究领域。

项目就不同地域、不同来源有机铁转化菌株分离筛选，最终获得了大于10000μg/ml的耐高铁菌株44株，随后进一步评价了菌株的铁富集转化能力，获得了具有高有机态结合铁转化菌株，其中菌株TGGY为烟曲霉菌属的一种变种，其有机铁含量最高，达到了62.34mg/g；较为安全的酵母属真菌YM1504为斯巴达克毕赤酵母属的变种。利用YM1504菌株制备获得了22.15 mg/g有机态结合铁，大鼠单剂量经口给予的药动力学证实，该有机铁吸收迅速，大鼠缺铁性贫血模型的治疗效果显示，其可以明显改善大鼠的缺铁症状，且补铁效果明显优于无机铁。研究通过构建扩散盒从未（难）培养微生物中进行了有机铁转化微生物的筛选分离及微生物多样性分析，提示未（难）培养微生物也是耐高铁转化菌的良好资源｡进一步进行了微生物转化锌、钙的研究，获得了具有较好锌、钙富集转化的菌株，其中菌株T-A胞内锌含量达到了19.15mg/g，鉴定与热带假丝酵母有87%同源性，证实为一株新菌。菌株T-1对钙的耐受较啤酒酵母增加了近100倍，鉴定为胶红酵母属的变种。本研究结果证实自然环境中存在有能耐受高铁的微生物，丰富了有机微量元素的研究，补充了利用自然界存在的微生物转化获得有机微量元素的新思路。通过耐高铁菌株中其铁载体的研究结果证实，耐高铁微生物在高铁环境中的铁转化与铁载体具有相关性，且主要是儿茶酚类铁载体。分离铁载体并添加酿酒酵母的活性验证结果证实，铁载体能明显增加酿酒酵母的铁耐受及富集转化能力。其中产铁载体优势菌株YP-12鉴定与胶红酵母具有97%的同源性，证实为一株新菌。利用其获得了有机铁含量为59.40mg/g的富铁酵母，能明显改善缺铁性贫血模型鼠的缺铁症状。在该理论的指导下，分别获得了有机锌、铜含量为44.22mg/g和60.76mg/g的富锌和富铜酵母，其中产铁载体优势菌株ZTH2X鉴定与具有青霉菌属86%同源性，证实为一株新菌，也证实铁载体作为一种运载工具与菌株金属离子的铁转运有关。提取菌株YM1504全基因组，采用PCR 技术扩增、测序、BLAST比对，分析菌体中的FET3基因序列所表达铁还原酶的特性，提示耐高铁菌株可能存在不同吸收转运酶分子结构。高铁转化菌规模放大培养后，分析其在菌体内的存在部位及储存状态，解析菌体细胞铁毒性耐受机理显示，铁离子主要分布在细胞壁和胞质溶胶，在胞内主要与蛋白质结合形成有机态铁。