甘肃当归内生菌生物多样性与药材高品质成因机理研究

There are rich herbal resources in Gansu, especially in Min County of Gansu province, where is the genuine producing region of Angelica sinensis, whose A. sinensis accounts for 85% of all artificially cultivated production in China. Due to the deterioration of the ecological environment, the quality of artificial A. sinensis declined, and compared with the wild A. sinensis, the quality difference was more obvious. Therefore, based on our previous research results that endophytes of A. sinensis and its active ingredients have a certain correlation, which can increase the formation of active ingredients of A. sinensi, we will further study on the mechanism of high quality formation of medicinal plants by endophytes from Angelica sinensis. In this study, the metagenomics combined with bioinformatics methods was used to compare and analyze the biodiversity of soil microorganisms and endophytic endophytes in wild and artificially planted A. sinensis in Gansu. Moreover, in the wild and planted areas of A.sinensis, the cultured endophytes and uncultured endophytes are isolated with the classic microbiology and in situ culture method, depending on morphological, molecular biology and other means, endophytic fungi is identified. Furthermore, combined with the results of biodiversity analysis, using plant cell suspension culture technology and the cultivation of sterile seedlings method, the mechanism of A.sinensis high quality formation by endophytes of A.sinensis is explored. The results of the present study will provide theoretical support for the improvement of quality and green development of A.sinensis, which will also be expected to provide guidance for other Chinese herbal medicine cultivation and quality improvement.

甘肃中草药资源丰富，是当归的道地产区，当归种植量占全国的85%。但由于生态环境恶化，人工栽植产区当归质量下降，并且与野生当归品质差距明显。本项目前期研究发现，当归内生菌与当归活性成分具有一定的相关性，能利于当归活性成分的形成。基于此，本研究进一步就当归内生菌改进药材品质形成机理进行深入的研究。研究利用宏基因组学技术并结合生物信息学方法，比较分析野生和人工栽植产区土壤微生物和当归内生菌的生物多样性。通过经典微生物学方法和原位培养法，分离野生和人工栽植产区当归中的可培养和难培养内生真菌，通过形态学、分子生物学等手段鉴定内生真菌。结合多样性分析的结果，利用植物细胞悬浮培养技术并结合无菌苗培养，研究内生菌不同组份对当归品质的影响，探讨内生菌改善药材品质的机理，以期为当归品质提高和绿色发展提供理论支撑，研究结果将有望为其他中药材种植，提高质量提供指导。

当归是著名的中药，应用广泛。本研究以甘肃道地药材当归为材料，通过甘肃宕昌县、岷县等道地产区野生、人工栽植当归及相应土壤样本的采集，以阿魏酸含量为质量评价指标并采用HPLC法进行含量检测。采用宏基因组学技术，对不同地域当归内生菌及其根际土壤中的微生物的多样性进行分析。采用不同化学分析方法对各土壤样本的不同化学特性进行检测，并进行关联性研究及分析。结果显示，野生当归中阿魏酸的含量高于人工栽培当归中的阿魏酸含量，野生和栽培当归品质存在差异。研究进一步以解析该差异可能存在的微生态因素为题，通过不同地域当归内生菌和根际土壤微生物多样性进行分析的结果显示，野生当归内生细菌和真菌的多样性高于栽培当归，野生当归根际土壤真菌菌落多样性较高，而栽培当归根际土壤细菌的多样性及真菌的菌落丰富度较高。不同地域野生和栽培当归土壤有机质、pH、Zn、Mn等土壤环境因子也有明显差异（P<0.05）。相关性分析结果显示，土壤有机质、微量元素Sc含量与当归阿魏酸含量具有相关性（P<0.05）。土壤有机质对当归内生真菌群落组成的影响程度大于土壤pH，土壤有机质和土壤pH对当归内生细菌群落组成的影响程度相近；土壤有机质、土壤pH及土壤微量元素Sc、Be、La、Nb等对当归内生菌及土壤菌落多样性均有显著影响（P<0.05），而当归内生菌群落多样性与当归阿魏酸含量的相关性不显著。进一步对当归内生菌及根际土壤微生物进行分离，对分离菌株代谢产物进行腺苷脱氨酶、抗菌等不同活性评价的结果显示了一定的潜在研究价值。研究采用不同分离微生物处理当归幼苗，发现内生真菌不仅能增加当归苗的根重，还能显著增加其阿魏酸的含量和阿魏酸总含量（P<0.05），而内生细菌和内生放线菌均无明显影响。进一步的添加研究显示，野生丝状真菌和栽培丝状真菌均能显著增加当归苗的阿魏酸含量和阿魏酸总含量，且两个处理组无显著差异，提示内生菌中发挥作用的可能是丝状真菌。研究有望为提升当归品质及其内生菌资源的合理利用提供重要的技术资料。