利用CRISPR-Cas9技术解析油菜叶绿素合成酶基因不同拷贝在维生素E代谢中的作用

Vitamin E is a kind of lipophilic active substances composed of tocotrienols and tocopherols. It is important for both human and livestock nutrition and can also be used as anti-oxidants in vitro. Rapeseed is one of the most important oil crops in China, its seeds are rich of vitamin E, but the content is generally about 300 μg / g, far from meeting the necessary for natural vitamin E. Our previous results showed that the chlorophyll synthase gene was negatively correlated with Vitamin E content in Arabidopsis. And, in Brassica napus L, the BnA9CHLSYN gene is also the “Negative regulator ” of Vitamin E content in seeds. There are four copies of CHLSYN genes in the genome of Brassica napus L. and their expression models are different. To data, there is little to know about the relationship of the Vitamin E synthetic ability with the four different BnCHLSYN copies. In this proposal, CRISPR-Cas9 gene editing technique is used to analyze the function of four chlorophyll synthase genes in the synthesis of vitamin E in Brassica napus L. This could help us to analyze the molecular mechanisms of Vitamin E metabolic pathways and breed high Vitamin E content germplasm resources in Brassica napus L.

维生素E是一类由生育三烯酚和生育酚组成的脂溶性活性物质，对人和牲畜营养都很重要，在体外还可作为强抗氧化剂。油菜是我国最重要的油料作物之一，其籽粒虽富含维生素E，但其含量一般在300μg/g左右，远不能满足人们对天然维生素E的需求。研究表明，拟南芥维生素E合成能力与叶绿素合成酶基因负相关，甘蓝型油菜中A9染色体上的叶绿素合成酶基因也是决定籽粒维生素E含量的“负调控因子”。叶绿素合成酶基因在甘蓝型油菜基因组中有4个同源拷贝，它们在表达模式上存在着时空特异性。目前，对这4个油菜叶绿素合成酶基因分别与籽粒维生素E合成能力的关系尚不明确。本项目拟采用CRISPR基因编辑技术，对这些拷贝分别进行敲除，结合其对生育酚的合成能力的影响，分析甘蓝型油菜四个叶绿素合成酶基因在维生素E代谢中的功能，为解析甘蓝型油菜维生素E合成代谢途径的分子机理以及创建籽粒具有高维生素E含量的甘蓝型油菜种质资源奠定基础。

维生素E是一种人体不能自主合成的重要抗氧化剂。拟南芥中生育酚合成的重要底物PDP约80%来源于叶绿素分解途径，前期研究证明叶片中叶绿素合酶（CHLSYN）的表达与生育酚含量呈负相关。本研究在拟南芥的研究基础上，证明了在拟南芥种子中 CHLSYN 表达也与生育酚含量呈负相关。GWAS分析结果发现油菜的A9染色体对生育酚的合成有较大的效应，结合CRISPR/Cas9 基因编辑技术，对甘蓝型油菜的CHLSYN基因的四个拷贝分别进行编辑。突变体的后代表型检测发现在叶片中，BnA9CHLSYN单拷贝突变体和BnA9CHLSYN和BnC8CHLSYN双拷贝突变体的生育酚含量相比野生型平均提高了3.36倍和2.45倍，在种子中，BnA9CHLSYN和BnC8CHLSYN双拷贝突变体的生育酚平均含量相比野生型提高了21%，且CHLSYN基因在A9C8拷贝上的突变不会引起植株表型上的差异和种子脂肪酸组分的改变。本研究获得了CHLSYN基因不同拷贝上的突变体材料，为进一步研究该基因的功能提供了依据，并为提高油菜生育酚的含量提供了良好的材料。