基于超细粒子吸附的Bt蛋白构象与生物活性和持效期关系研究

Bt游离态蛋白在土壤中释放后很容易被矿物粒子吸附，一旦吸附完成，则表现为杀虫活性提高、对微生物和酶的降解产生抗性，持效期显著延长的特性。这些特性使转Bt基因作物的种植存在潜在的残留风险。截至目前，有关Bt蛋白与土壤矿物的吸附机理、吸附后Bt蛋白构象如何变化、构象变化与生物活性和持效期的关系，鲜见文献报道。本课题选用超细粒子吸附Bt蛋白，采用圆二色性光谱直接表征吸附层Bt蛋白的二级结构变化，并测定构象改变前后Bt蛋白的杀虫活性和持效期，利用数理统计法建立构象与活性和持效性的关系。利用X射线光电子能谱分析Bt蛋白与超细粒子结合后键能变化，红外光谱分析功能基团的改变，差示扫描量热法测定变性温度的变化，为吸附类型的判定提供实验证据。本课题研究有助于揭示Bt蛋白吸附机理，从分子构象的角度阐明吸附态Bt蛋白活性提高和持效期延长的生物化学本质，为科学评价其环境风险奠定实验基础。

本研究采用紫外、荧光、圆二色谱对Bt蛋白与超细矿物作用前后的构象进行表征，采用XPS和FTIR解读Bt蛋白功能团变化。首次发现：（1）温度、pH、离子强度均对Bt蛋白构象有较大影响，但在常规气候条件下，pH和离子强度是影响Bt蛋白构象的主要因素；（2）金属离子可以引起Bt蛋白的荧光猝灭，这一过程不属于动态猝灭，而是生成离子-Bt蛋白复合物的静态猝灭机制；（3）Bt蛋白溶液与超细矿物混合后，α螺旋、β折叠和β折角含量呈下降趋势，无规卷曲含量增加；（4）Bt蛋白吸附量与α螺旋含量成反比，与Random含量成正比；（5）在不同条件下，Bt蛋白解吸率与α螺旋有关，但与β折叠、Turn转角和Random含量的关系随条件而发生变化，提示温度、pH和离子强度是以不同的作用机制来影响Bt蛋白构象；（6）Bt蛋白的降解速率与α螺旋、Turn转角含量成正比关系，而与β折叠和Random的含量成反比关系；（7）Bt蛋白存在形态对活性影响很大，其中Bt固态蛋白的活性远低于Bt液态蛋白。Bt液态蛋白被矿物吸附后，活性并没有发生大的改变，但持效期延长。（8）揭示了Bt蛋白与矿物发生吸附的作用机制，证实Bt蛋白是通过氨基基团与矿物发生结合，且吸附发生后，Bt蛋白的变性温度未见明显改变。上述结果揭示了Bt蛋白与超细矿物的作用机制，解析了构象与活性及持效期的关系，获得了环境因素对Bt蛋白构象产生影响的直接证据，为风险评价和调控奠定了科学基础。