基于转录组学的牛大力块根形成与膨大的机理研究

Callerya speciosa (Champ.) ScHot is a genuine medicinal and edible plant from Guangxi which roots have long been used for food and as a traditional medicinal herb.Our previous research showed that the ability of tuberization was so weak that only few fibrous foots could transform to tuberous roots on special position but more could not. To improve the quantity of Callerya speciosa, the mechanism of tuberous roots formation is needed to be illuminated. Therefore, this study will accomplish the following work ,via collecting roots and leaves from several different developmental stages as samples: Firstly, the regularity of tuberous roots formation will be learned and the critical period of its formation will be determined, via observing the microscopic and submicroscopic structure, determining the endogenous hormones and physiological and biochemical indexes.Secondly, the Solexa high-throughput sequencing technologies will be used to analyze the samples from the key stages and excavate the key genes which regulate tuberous roots formation. RACE cloning technologies will also be used to clone the key genes. Thirdly, qRT-PCR and western blot technologies will be used to verify the expression of those key genes, by using the roots and leaves from several different developmental stages. This study will provide a theoretical basis and technology innovation of the directional cultivation techniques and low-quantity problem for Callerya speciosa (Champ.) ScHot and tuberous plants.

牛大力是药食两用的广西道地药材，以块根入药。申请者前期研究发现牛大力结薯率低，仅少数根的某些部位膨大成块根，大多发育成梗根，产量受到严重影响。为了突破这一瓶颈，探讨块根形成与膨大机理，本项目拟对不同膨大阶段的牛大力块根和叶进行取样，主要研究：①显微与亚显微结构、内源激素及生理生化变化，掌握块根膨大过程的结构变化及生理机制，筛选出块根膨大的关键时期，为下一步进行转录组测序提供依据；②在块根膨大的关键时期，利用Solexa测序技术对块根进行转录组测序分析，挖掘与块根膨大相关的候选基因；利用RACE技术对候选基因进行全长克隆及生物信息学分析；③利用qRT-PCR与western blot方法，对不同膨大阶段的块根和叶进行检测，掌握候选基因的时空表达规律，筛选出与块根膨大高度相关的关键基因，揭示块根形成与膨大的机理，为解决块根类药材产量低的难题与实现定向栽培提供理论依据和技术支撑。

牛大力是药食两用的广西道地药材，以块根质量最佳，但生产上仅少数根的某些部位膨大成块根，产量与品质受到严重影响。为了突破这一瓶颈，本项目对牛大力块根膨大过程的组织形态结构、内源激素及生理生化变化、基因表达等进行了系统的研究。通过组织形态观察发现，牛大力块根膨大主要依靠活跃的维管形成层细胞不断分裂产生次生木质部和次生韧皮部，发育后期木薄壁细胞含有大量的淀粉粒。随着块根发育，类黄酮成分芒柄花素与高丽槐素含量呈不断增加的变化趋势；采用UPLC-MS/MS技术分析得到牛大力块根膨大过程中IAA和GA3含量均显著升高，c-玉米素 (cZ)在块根快速膨大期达到峰值，JA含量在启动膨大期最高，而ABA含量则在膨大后期含量最高。淀粉与蔗糖分别是牛大力块根中含量较高的多糖与可溶性糖，在牛大力块根发育过程中，多糖类物质的含量逐渐增加，而可溶性糖含量逐渐减少，两者之间呈显著负相关；蔗糖的分解代谢是蔗糖合酶（SUS）、磷酸蔗糖合酶（SPS）、酸性转化酶（AI）与中性转化酶（NI）等多种相关酶协同作用的结果。利用Solexa高通量测序技术对块根膨大的关键时期（移栽6、12、18、30个月）进行了转录组测序分析，共得到78.23 Gb clean reads，利用Trinity软件，组装得到153,153个unigenes，原始数据已提交至NCBI SRA数据库（SRP223620）；共鉴定出4,337个差异基因（DEGs），采用K-means聚类方法对差异基因进行了聚类分析，得到6个聚类，其中820个DEGs在块根迅速膨大时期高表达，主要富集于“苯丙氨酸生物合成”、“类黄酮生物合成”和“类异黄酮生物合成”等途径。进一步地，我们得到了18、36、15个分别参与蔗糖与淀粉代谢、激素信号转导、异黄酮生物合成等方面的关键DEGs；同时，一些转录因子、MAPK与钙信号、细胞壁与细胞周期等方面的基因也参与了牛大力块根的膨大。我们还对SUS、CHS、MC1等关键基因进行了时空表达规律分析与克隆。本项目首次利用转录组技术对不同发育时期牛大力块根进行了系统研究，阐释了牛大力块根形成与膨大的机理，研究结果可为提高药材产量与品质提供理论依据和技术支撑。