用于肠道致病菌快速高灵敏检测的电化学传感技术研究

肠道致病菌经水和食物传播,导致的感染性腹泻严重威胁人类健康；肠道致病菌感染的暴发和流行已经成为全世界主要的公共卫生问题。现有的检测技术远不能满足传染病预防控制和临床诊疗的需要。本项目将电化学分析技术与纳米技术、分子生物学技术结合，利用链接化学技术、核酸适体技术、核酸酶技术、滚环扩增技术，通过纳米粒子的生物标记、传感器表面的生物功能化和纳米信号放大，原创性提出一系列快速、灵敏的现场检测肠道致病菌的实用性新方法；建立各种肠道致病菌及其DNA、致病毒素的超灵敏、特异性检测新技术；创建用于肠道致病菌快速、灵敏、准确、现场检测的新型电化学生物传感体系；现场快速诊断感染性腹泻的病原体,为及早采取防控措施，阻止肠道致病菌的爆发流行,感染性腹泻的临床诊疗提供强有力的技术支持；对保证食品卫生安全，防止突发性公共卫生事件的发生具有重大意义。

本项目基于肠道致病菌的检测方法及研究现状，原创性提出一系列快速、灵敏的现场检测肠道致病菌的实用性新策略和新方法。具体内容如下：（1）基于特异性识别分子功能化纳米材料的无试剂肠道病原菌电化学传感器：课题组建立了一种检测沙门氏菌的电化学传感器：根据致病性沙门氏菌的特异性InvA基因设计寡核苷酸探针，通过引入生物素-亲和素系统和具有强大催化作用的酶，构建了高灵敏和高特异的电化学DNA传感器，同时联用PCR技术，在3.5 h内可以完成10 CFU mL-1沙门菌的检测，为致病性沙门氏菌的检测提供了有力的工具。（2）基于功能化多通道丝网印刷电极芯片的多组分肠道病原菌电化学传感器：使用生物功能化的多通道丝网印刷电极芯片捕获待测病原菌，利用不同特异性识别分子通道分辨数种肠道致病菌，以电化学活性分子标记的具有广谱细菌结合能力的生物大分子作为信号源，构建多通道多组分电化学传感平台，实现多种肠道致病菌的同时检测。（3）核酸适体功能化纳米粒子用于肠道病原菌富集和高灵敏检测：课题组建立了一种新型的电化学适体传感器，对肠致病性大肠埃希菌进行灵敏、快速的检测，该传感器可在6.5 h内直接检测到87 CFU mL-1, 并能应用于实际样品的检测，其在牛奶中的最低检测限可达228 CFU mL-1，为实际样本中致病性大肠埃希菌的检测提供的强有力的工具。（4）核酸酶、核酸适体双功能化的生物纳米探针用于肠道病原菌的超灵敏检测：为了进一步提高电化学传感器对于细菌检测灵敏度，课题组结合外切酶的酶切特性与PCR扩增技术，建立了超灵敏的大肠杆菌基因检测方法。该双重放大技术的应用使得待测基因的最低检测限达到8.7 fM，且线性范围宽，重复性好。（5）电化学传感器用于肠道致病菌DNA和毒素的超灵敏检测：课题组研究了电化学免疫传感器对蛋白质的测定，为在细菌毒素和蛋白检测方面打下了坚实基础。利用自制电化学免疫传感器直接检测血清中神经元特异性烯醇化酶并将单壁碳纳米管和金纳米粒子用于信号放大，以提高灵敏度，其最低检出限可达0.033 ng/mL，与传统检测方法相比具有灵敏度高，线性范围宽，简单快速，直接检测的特点。