去泛素化酶USP7 C端结构域的调控机制及化学干预

Protein deubiquitination is an important aspect of dynamic modification of biological macromolecules. Deubiquitinase USP7 over-expressed in many tumors enhances abnormal stability of oncogenic proteins (e.g. MDM2, DNMT1, LSD1), and thus promotes tumorigenesis and progress. C-terminal domain of USP7 (USP7CTD) not only recognizes and binds substrate proteins, but also plays a key role in allosteric activation and maintenance of USP7 enzymatic activity. In previous studies, we found a couple compounds (SGI-1027 and II-12) that bound to USP7CTD, and carried out preliminary studies on the effects of the compounds on the enzymatic activity and the interaction between USP7CTD and DNMT1. This project centres on the key scientific question of the major program “Chemical interference of dynamic modification of biological macromolecules: novel drug target based on dynamic modification and targeted interference new strategy”, and will focus on USP7CTD in order to disclose the regulatory mechanism of USP7CTD, examine whether USP7 could be a druggable target for treating myelodysplastic syndrome (MDS) and related tumors, and develop lead compounds with high potency and high specificity. Together, we wish this project would provide novel drug target and compound candidates for the therapy of MDS and related tumors.

蛋白的去泛素化是生物大分子动态修饰的一个重要方面。在多种肿瘤中高表达的去泛素化酶USP7通过去泛素化作用提升了一些致癌蛋白（如MDM2、DNMT1和LSD1等）的异常稳定性，因而促进了肿瘤的发生发展。USP7 C端结构域不但参与识别并结合底物蛋白，而且对变构激活并维持USP7的酶活性也发挥重要作用。前期研究发现了可作用于USP7 C端结构域的先导化合物（SGI-1027和II-12），并初步研究了化合物对USP7 C端-DNMT1相互作用及酶活性的影响。本项目围绕重大研究计划的核心科学问题“生物大分子动态修饰的化学干预：基于动态修饰的新药靶和靶向干预策略”，针对USP7 C端结构域开展系统研究，期望揭示USP7 C端结构域的调控机制，确证其是否可成为治疗骨髓增生异常综合症（MDS）及相关肿瘤的新靶标，并发展高特异性的化学干预新策略，为MDS及相关肿瘤的药物干预提供新药靶及候选化合物。

去泛素化酶USP7通过去泛素化作用提升了一些靶蛋白（如MDM2、DNMT1和NF-kB等）的稳定性，因而与肿瘤和炎症密切相关。USP7 C端结构域（USP7CTD）不但参与识别并结合底物蛋白，而且对变构激活USP7的酶活性也发挥至关重要的作用。前期研究发现了可作用于USP7CTD的苗头化合物（II-12），在此基础上，本项目针对苗头化合物进行结构优化，并获得了化合物II-59与USP7 C端蛋白的复合物共晶，结构解析发现共晶中的USP7 C端蛋白构象发生了改变，推测可能是化合物II-59的结合诱导了其构象改变。为此，我们以II-59为先导化合物进行了进一步的结构改造，设计并合成了100多个目标化合物。通过表面等离子体共振法（SPR）测定目标化合物与USP7 C端蛋白的亲和力来进行初步筛选。结果显示，优选化合物B6与USP7 C端蛋白的亲和力最强，Kd为360 ± 140 nM。因此，我们对化合物B6进行进一步的生物学评价。研究表明，化合物B6显著抑制USP7 C端蛋白与底物蛋白DNMT1的蛋白-蛋白相互作用并降低RS4;11细胞中的DNMT1蛋白水平。体外抗肿瘤活性表明，化合物B6对血液肿瘤细胞NB4（IC50 = 11.86 ± 3.95 μM）和RS4;11（IC50 = 7.16 ± 1.09 μM）具有明显的增殖抑制活性，而对正常细胞系MRC-5的抑制作用较小（IC50 = 45.59 ± 24.67 μM）。此外，在小鼠巨噬细胞系Raw264.7细胞中，化合物B6呈现剂量依赖性地抑制LPS诱导的炎症因子Il6和Il1b基因表达，表明化合物B6具有一定抗炎活性。化合物B6在小鼠体内的药代动力学研究表明，B6可口服吸收，其小鼠口服生物利用度为19.54%。进一步的体内药效学研究正在进行中。本项目研究成果填补了USP7 C端调控剂研究领域的空白，为后续研制first-in-class抗肿瘤和抗炎新药奠定基础。.