mRNA-蛋白质相互作用的超高分辨成像研究

mRNA-protein interactions play key roles in gene expression. mRNA-protein interactions are also found being involved in several human diseases and virus-host interactions. Visulization mRNA-protein interactions directly in cells by super-resolution fluorescence imaging technique will help understanding the mechanism of gene expression and viral infection. However, so far, there is still no method for super-resolution fluorescence imaging of mRNA-protein interactions in cells. In this proposal, based on the technique of protein-fragment complementation and fluorescent protein mIrisFP with photoactivatable and photoswitchable properties, we will attempt to build new trimolecular fluorescence complementation (TriFC) systems for STORM/PALM super-resolution microscopy for imaging mRNA-protein interactions. Then, the newly constructed TriFC system will be used for imaging some of mRNA-protein interactions in influenza A virus infection. Interactions between some of influenza A virus mRNAs, cellular interferon mRNAs and the viral NS1 protein will be imaged and analyzed in cells. The planning study will develop new fluorescent protein-fragment complementation systems for imaging of mRNA-protein interactions with super-resolution.The study will also provide further understanding of influenza A virus mRNA-protein interactions, which will help to understand the virus-host interactions and pathogenicity of influenza A virus.

mRNA-蛋白质相互作用是基因表达过程的重要内容，与疾病发生、病毒-宿主相互作用等密切相关。原位高分辨可视解析mRNA-蛋白质相互作用能更好地理解基因表达调控和病毒侵染机制，但是目前对mRNA-蛋白质细胞内相互作用仍缺乏超高分辨成像研究方法。本申请拟结合蛋白片段互补技术和光控荧光蛋白mIrisFP的双重光活化特性，拆分并构建mIrisFP双分子和三分子荧光互补系统，建立mRNA-蛋白质相互作用STORM/PALM超高分辨成像分析新方法。并以甲型流感病毒mRNA-蛋白质相互作用为研究对象，将mIrisFP三分子荧光互补系统超高分辨成像技术用于细胞内流感病毒mRNA及宿主干扰素mRNA与流感病毒NS1蛋白相互作用研究。本申请将发展mRNA-蛋白质相互作用超高分辨成像新技术，深入解析甲型流感病毒重要mRNA-蛋白质相互作用行为，为理解流感病毒与宿主细胞相互作用关系以及病毒侵染与致病机制提供基础。

蛋白质常常以复合体形式发挥功能。在细胞内原位监测多蛋白复合体，对其功能解析极为重要，但一直存在方法学挑战。而且，由于受到普通光学显微成像分辨率限制，蛋白复合体内亚基相互作用的精细成像研究难以实现。项目组利用具有光激活和光转换特性的mIrisFP荧光蛋白，首先筛选合适的拆分位点构建mIrisFP双分子荧光互补系统（BiFC），进而又把mIrisFP拆分为三个片段，成功构建了三片段荧光互补系统（TFFC）。BiFC和TFFC结合光激活定位成像技术，实现了蛋白-蛋白以及蛋白三聚体亚基间相互作用的超高分辨成像，空间分辨率可精确到40纳米。利用TFFC-PALM技术，实现了G蛋白三聚体亚基间相互作用的单分子水平成像，解析了G蛋白αβγ异源三聚体与βγ异源二聚体在亚衍射细胞空间的不同分布模式，揭示了霍乱毒素导致αs亚基与βγ异源二聚体亚基解离的动态过程；并且实现了FSCN1-HOTAIR相互作用的单分子水平成像，并解析了FSCN1-HOTAIR相互作用与actin在亚衍射细胞空间的共定位分布模式；实现了流感病毒PB2, PB1和PA三聚体的超分辨成像。该研究为蛋白三聚体在细胞内的鉴定和监测提供了简便可视的方法，可实现其在细胞内单分子水平和纳米尺度超分辨成像研究，并为G蛋白在细胞信号转导过程以及流感病毒PA, PB1和PB2这三个蛋白存在相互作用的功能提供了更深入的理解。