传统中药抗帕金森病活性成分筛选及物质基础的质谱研究

On the basis of previous work, according to the two major pathological features of Parkinson's disease (PD), the project proposes a new method for screening active ingredients from Ginseng, Ginkgo Biloba, and traditional prescription ShouWuFang based on the effect of regulating neurotransmitter balance and antiapoptotic effect for nerve cell. Firstly,using newly synthesized and MS sensitizing rhodamine derivatization reagent, the project intends to develop a UHPLC-MS/MS (MRM) determination method for simultaneous and multi-analyte detection of neurotransmitters. By means of evaluating neurotransmitter content by MS detection and antiapoptotic effect by MTT and ELISA method, an optimal cell model will be chosen from from MPP+, 6-OHDA and rotenone injurying SH-SY5Y and PC12 cell model. Anti-Parkinson active ingredients will be screened from Traditional Chinese Medicine (TCM) on this PD cell model and the synergistic effect will be studied. The active ingredients screened from PD cell model will be verified on PD rat model by in vivo microdialysis technology. The strong active ingredients simultaneously verified by cell and animal models will be identified mainly by mass spectrometry and the material basis will be clarified. The research model of this project will provide a simple, efficient, economical and viable approach for screening anti-Parkinson active ingredients from TCM.

本项目在前期工作基础上，针对帕金森病(PD)两大病理特点，提出以调节神经递质平衡作用和抗多巴胺能神经细胞凋亡作用为依据的活性成分筛选方法，从人参、银杏叶和传统方剂首乌方中筛选活性成分。首先，利用新近合成的罗丹明类衍生试剂带来的质谱增敏技术，建立同时检测多种神经递质的UHPLC-MS/MS(MRM)分析方法，通过质谱法检测神经递质含量，以及MTT法和ELISA法评价抗细胞凋亡作用的手段，从MPP+、6-OHDA和鱼藤酮分别损伤的SH-SY5Y和PC12细胞模型中优选一种最佳细胞模型，筛选中药活性成分并进行协同作用研究；对细胞模型筛出的活性成分，采用PD大鼠模型活体微透析技术，以调节神经递质平衡作用为依据进行活性验证；对细胞和动物模型共同确定的强活性成分进行以质谱法为主的结构鉴定，明确药效物质基础。该项目的研究模式将为中药抗PD活性成分探寻提供一种简便快捷、经济可行的新途径。

本研究工作基本按计划执行。以调节神经递质平衡作用和抗多巴胺能神经细胞凋亡作用为依据，建立了帕金森病（PD）细胞模型筛选结合PD大鼠模型活体微透析药效验证的抗PD活性药物成分筛选方法。（1）同时检测多种PD相关的神经递质及其代谢链成分对相关疾病的诊断、治疗以及药效评价和药物筛选具有重要科学意义。本项目开发了针对微量的细胞样品或活体大鼠微透析液样品的快速、高效样品前处理技术和高灵敏、高准确度超高效液相色谱三重四极杆质谱（UHPLC-MS/MS）检测技术，检出限达nmol/L~pmol/L水平，样品前处理时间极大缩短，与已报道分析方法相比在灵敏度、抗基质效应和快速性方面具有显著优势，为本项目相关研究奠定了坚实基础。采用已得到报导证实的黄芩素作为抗PD活性药物成分，综合评价其在PD细胞模型中的调节神经递质平衡作用和抗多巴胺能神经细胞凋亡作用（MTT法），优选得到了一种适合本项目活性成分筛选的PD细胞模型：1-甲基-4-苯基吡啶离子(MPP+)损伤的PC12神经细胞模型。采用该细胞模型，从本项目关注的中药方剂首乌方（高、低剂量组）以及一些中药单味药（人参、黄芩、厚朴、天麻、钩藤）中筛选活性成分。（2）搭建了快速、有效的活体大鼠药效评价平台：活体大鼠脑微透析液动态、连续取样→快速、高效样品前处理技术→高灵敏、高准确度UHPLC-MS/MS检测神经递质浓度用于评价药效，主要考察了首乌方剂及其主药潜在抗PD活性成分的药效作用及量效关系。（3）同步监测活体大鼠内源性生物标志物和外源性药物浓度变化，具有极大的挑战性和重要的科学价值。本项目采用活体微透析血-脑双探针取样技术，联合衍生化-微萃取-UHPLC-MS/MS分析技术，实现了同步监测活体大鼠脑纹状体微透析液中多种神经递质浓度变化和颈动脉血管中典型抗PD药物黄芩素的药代动力学，为活体动物抗PD药效评价和药物筛选提供了一种可靠、快速的研究平台系统。