基于量时毒关系和ComplexI-ROS-Prdx6通路的亚硫酸氢钠穿心莲内酯肾毒性研究

亚硫酸氢钠穿心莲内酯（ASB）的肾毒性已成为其临床应用的严重障碍，但有关其肾毒性及机制方面基础研究薄弱。本项目在前期研究工作基础上进一步采用微透析技术，实时在线地监测ASB干预后大鼠血液和肾组织药物浓度，同步测定毒效指标，阐明其量时毒关系和毒靶器官损伤程度的相关性；同时以NDUFA10和Prdx6为主要研究靶点，探究ASB干预下线粒体NDUFA10修饰位点和方式，细胞内氧化还原环境的变化和Prdx6酶活性及同形态分布含量，阐明Prdx6表达变化与外界环境关系，从ComplexI-ROS- Prdx6信号通路探讨ASB肾毒性的线粒体损伤机制；本项目的研究可为莲必治注射液的临床安全使用提供科学依据，并可构建中药肾毒性研究和评价技术平台，为具有肾靶毒性中药的安全性评价研究提供一个高效创新的实验体系。

亚硫酸氢钠穿心莲内酯（ASB）是由穿心莲内酯与亚硫酸氢钠加成后制成的水溶性衍生物，因国家药监部门通报过多起急性肾功能损害病例并对临床用药提出警示，因此本课题主要围绕ASB肾毒性，从作用机制，代谢产物，量时毒等方面进行研究。一是在体外实验中发现在ASB（0~60mmol•L-1）诱导HK-2细胞产生大量ROS，活化JNK信号通路，通过Caspase依赖的线粒体途径诱导细胞凋亡，同时上调Beclin-1蛋白诱导细胞自噬。二是采用代谢组学分析大鼠尿液，发现与空白对照组相比，ASB 100 mg•kg-1干预后，大鼠尿液中7中代谢物发生变化，ASB 600 mg•kg-1干预后，大鼠尿液的4钟差异代谢物，1，5-脱水葡萄糖醇, D-赤-鞘氨醇和β-酮己二酸可作为潜在ASB肾毒性生物标志物。ASB高剂量干预后，大鼠机体代谢功能或代谢途径受到严重干扰或抑制，使得某些代谢物在尿中检测不到，同时也揭示了ASB引起机体代谢途径的异常改变。三是采用蛋白质组学分析肾脏线粒体蛋白质，发现13个线粒体差异蛋白，与ROS水平调控有关：过氧化物酶-1（PRDX1），细胞色素C氧化酶5B（COX5B）；与能量代谢有关：苏氨酸-tRNA连接酶，丙酮酸脱氢酶E1亚基(PDH-β)，异柠檬酸脱氢酶a-亚基（IDH3A），腺苷酸激酶2（KAD2）；与细胞增殖、分化、凋亡或自噬过程相关：N, N-二甲基精氨酸水解酶（DDAH1），甲基丙二酸半醛脱氢酶（MMSA），电压依赖性阴离子选择性通道蛋白2（VDAC2），电压依赖性阴离子选择性通道蛋白1（VDAC1)，线粒体ES1同源蛋白，热休克蛋白71（HSP7C），抑制素（PHB）。四是考察ASB单次给药大鼠的体内动力学，ASB的血药浓度-时间曲线，肾组织药浓度-时间曲线均符合一室模型和线性动力学特征。随着剂量的增大，ASB在大鼠体内的毒代动力学参数发生了一定的变化，ASB入肾变快，从肾脏中消除变慢，大鼠体内可能存在的蓄积现象。五是对系列穿心莲内酯衍生物（穿心莲内酯，莲必治，炎琥宁，穿琥宁）细胞毒性观察和比较发现，穿心莲内酯细胞毒性较大。另外发现除ROS介导的线粒体途径外，初步发现内质网应激也参与细胞凋亡，具体机制需进一步探索。以上这些发现为莲必治临床用药提供了一定的指导作用。