三维皮肤组织模型中α粒子诱导旁效应的机制研究-miR-21对氧化代谢的调控

The occurrence of ionizing radiation-induced bystander effects challenges the conventional target dogma. Thus, it may have an impact on estimation of radiation cancer risk, particular at low radiation doses, and outcomes of radiotherapy. However, the underlying mechanisms of bystander response still remain unclear. Based on our previous finding that reactive oxygen species (ROS) play an important role in bystander response, we propose to investigate the effect of regulation of ROS by miR21 in α-particle-induced bystander response in three-dimensional skin model, and compare it to the effect in monolayer cell culture (two-dimensional) as well. Using p53 binding protein 1, micronucleus formation， apoptosis and proliferation as endpoints, observe the alterations in unirradiated bystander cells after co-cultured with irradiated sigaling cell; Measure the change in the expression level of miR21 and superoxide dismutase 2 (SOD2) in signaling and unirradiated bystander cells; Study the effect of overexpressed and inhibited miR21 in signaling and bystander cells on bystander response to confirm that miR21 can modulate radiation-induced bystander effects. Moreover, analyze the effect of overexpressed and inhibited miR21 on cellular SOD2 expression level and ROS level; By adding ROS scavengers and hydrogen peroxide producer, demonstrate our hypothesis that miR21 modulate radiation-induced bystander response through regulating cellular redox status. These expected results may help elucidating the molecular mechanisms of radiation-induced bystander effects.

电离辐射诱导旁效应打破了传统的靶理论从而将对低剂量电离辐射健康危害及放疗效率的评估产生重要影响。然而旁效应的机理却仍不清楚。本项目在前期研究发现活性氧（ROS）在旁效应中起着关键作用的基础上，拟在自己构建的三维皮肤组织模型中和二维单层细胞培养条件下研究miRNA对ROS的调控在α粒子诱导旁效应中的作用。以P53结合蛋白1、微核、细胞凋亡和细胞增殖等为指标，观察未受照射旁效应细胞与受照射信号细胞相互作用后的变化；检测信号细胞和旁效应细胞中miR-21和超氧化物歧化酶2（SOD2）表达水平的变化；研究miR-21在旁效应和信号细胞中过表达和被抑制对旁效应的影响，以确证miR-21可调控电离辐射诱导的旁效应；分析miR-21过表达和被抑制对细胞胞内SOD2和ROS水平的影响，论证miR-21可通过调节旁效应细胞和信号细胞的氧化还原状态来实现对旁效应的假说。预期结果将有助于阐明旁效应的分子机制。

传统放射生物学认为细胞只有受到直接电离辐射才会产生损伤。然而大量数据显示受照射细胞可通过向未受照细胞传递信号而导致未受照细胞出现生物学变化，这种效应被称为电离辐射诱导的旁效应。旁效应具有重要的理论意义和现实意义。但是旁效应的发生分子机制目前仍不清楚。其中包括：miRNA，一类在细胞增殖、分化、死亡等生物过程中发挥重要调控作用的小非编码RNA是否对旁效应具有调控作用？并且，有研究显示TGF-β1可能是信号分子，但具体机制是什么？本项目从旁效应产生所需的三个要素即受照信号细胞、信号分子和未受照旁效应细胞分别进行了研究。从信号细胞通路的角度：HaCaT信号细胞受到α粒子照射后，miR-21表达持续降低，TGF-β1/Smad2通路被激活，这两者之间存在互相调控的关系，由此向培养液中释放旁效应信号分子，从而在与之共培养的WS1细胞中诱导微核的产生。从旁效应细胞通路的角度：WS1细胞与受α粒子照射的HaCaT细胞共培养后，其胞内miR-21表达增加，导致SOD2表达下降，由此引起胞内ROS水平上升，WS1细胞处于氧化应激状态，细胞产生DNA损伤。另外在H1299细胞中发现1h RCM导致旁效应细胞出现DNA损伤，而18 RCM导致旁效应细胞出现增殖抑制，并且信号细胞和旁效应细胞中的TGF-β1通路对旁效应现象的产生同样重要。H1299细胞在受照后1h不释放活性TGF-β1，而在照后18h有显著的释放，提示除了活性TGF-β1外，应该还有别的信号分子在调控旁效应的发生，而这个/些信号分子的释放与受照细胞中的TGF-β1通路有关。1 h RCM导致旁效应细胞中的miR-21表达升高，18 h RCM导致旁效应细胞中的miR-21表达降低；并且，miR-21不仅是旁效应的一个表现，更是一个非常重要的调控因子，miR-21的不同变化调控着1 h RCM和18 h RCM导致的不同的旁效应。另外，miRNA-27a和27b可作为信号分子来调控旁效应细胞的增殖速度。本项目通过确凿的证据证实miRNA可通过调控信号细胞和旁效应细胞中的信号转导和自身作为信号分子来调控旁效应的发生，并且将miR-21与TGF-β1联系起来，解释了TGF-β1在旁效应中的一种工作机制。我们的研究成果丰富了旁效应的发生机制，具有重要理论意义。