miR-29b调控紧密连接蛋白claudin-1的表达对肠屏障功能的影响及其机制

The tight junction (TJ) is the apical-most element of the junctional complex and seals intestinal epithelial cells together in a way that prevents even small molecules from leaking between cells. Claudin-1 is a main structural component of TJs and is crucial for the assembly of TJ complex, but the exact mechanism that regulates claudin-1 abundance remains elusive. microRNAs (miRNAs) are a class of small non-coding RNAs that have emerged as major regulators of gene expression. Our group have recently found that miRNA-503 (miR-503) represses expression of RNA-binding protein CUGBP1 in intestinal epithelial cells (IECs) and that CUGBP1 in turn alters the expression of CUGBP1 target mRNAs and thus contributes to the epithelial homeostasis. These studies will be conducted in Caco2 cells. Interactions of miR-29b with the claudin-1 mRNA will be examined by biotin-labeled miRNA pull-down assays. The stability of claudin-1 mRNA will be examined by measuring its half-life. The functions of miR-29b will be investigated by miRNA silencing and ectopic overexpression of miRNA precursors. The barrier function will be detected by TEER and paracellular tracer flux assay. This study will determine the role of miR-29b in the regulation of claudin-1 expression and the intestinal epithelial barrier function.

肠黏膜屏障是体内重要的防御屏障，紧密连接蛋白claudin-1在其中起着重要作用。预实验发现小鼠在禁食时肠黏膜中的miR-29b表达增高，黏膜通透性增加；生物信息学分析显示claudin-1 mRNA上有miR-29b的结合位点。因此推测miR-29b可能通过调控claudin-1对肠上皮黏膜屏障功能进行调节。本项目拟：研究miR-29b对肠黏膜上皮细胞单层细胞跨膜电阻值、异硫氰酸荧光素右旋糖酐透过率的调节，探讨紧密连接蛋白claudin-1在其中的作用，通过构建包含miR-29b结合序列的报告基因质粒，利用免疫荧光、PCR、蛋白印迹和Pull-down等技术阐明miR-29b抑制claudin-1的分子机制；通过动物实验揭示干预miR-29b/claudin-1对肠黏膜屏障功能障碍的影响。为深入研究肠黏膜屏障功能障碍形成的分子机制和探索可能的治疗手段提供实验依据，具有重要临床意义。

肠黏膜屏障是人体内最重要的防御屏障之一。它能选择性的吸收营养物质，水和电解质，而阻止细菌、毒素及抗原物质进入组织器官和血液循环，维持机体正常的能量和营养需求又能保护机体不受各种外来致病因素的影响。当炎症因子、氧化应激、营养不良、肠道菌群失调时会导致肠黏膜损伤、萎缩引起屏障功能的障碍。肠黏膜屏障完整性得以维持的结构基础是肠上皮细胞形态和功能的正常及细胞间的紧密连接(TJ)的形成，紧密连接蛋白claudin-1在其中起着重要作用。已有研究发现多种microRNAs参与肠粘膜上皮细胞功能的调节，其中microRNAs可以调控紧密连接蛋白的表达，但是其机制仍不十分清楚。我们研究了炎症因子TNF-a对肠黏膜屏障功能和紧密连接蛋白的影响，探讨了miR-29b在其中的作用。在本基金支助下：1）我们发现炎症因子TNF-a可以破坏肠粘膜屏障功能，使肠粘膜上皮细胞的通透性增加。TNF-a可以通过抑制紧密连接蛋白claudin-1表达调控肠黏膜屏障功能。2）我们通过体外细胞实验和动物实验发现TNF-a可以调节miR-29b的表达。3）我们发现miR-29b能直接与紧密连接蛋白claudin-1 mRNA的3’-UTR结合，结合后通过促进claudin-1 mRNA在P-小体中的聚集和降解抑制其表达的。4）TNF-a通过调节miR-29b的表达进而调控紧密连接蛋白claudin-1表达调节肠黏膜屏障功能。我们的研究深入探讨了炎症因子TNF-a可以通过microRNAs调节紧密连接蛋白claudin-1的表达，影响肠粘膜屏障功能的机制，为深入研究肠黏膜屏障功能障碍形成的分子机制和探索可能的治疗手段提供实验依据，具有重要临床意义。