新的纺锤体蛋白INMAP的功能及其与细胞增殖关系的深入研究

在国家自然科学基金支持下，完成了两个有丝分裂器相关蛋白的基本定位和初步功能研究。其中的INMAP是一种新的纺锤体蛋白，在分裂期结合于纺锤体，在间期呈多点状分散于细胞核中；稳定过表达的INMAP导致细胞的纺锤体组装异常、多中心体和多核现象，微管束不能完全结合到中心体上，以及间期微管网络不能明显聚集等。因此，INMAP在纺锤体形成和细胞周期进程中可能发挥重要作用。本项目将集中力量深入到INMAP的功能调节研究中，并揭示其与细胞增殖及癌化的关系，使研究获得实际价值。本项目将通过Tet-Off可调基因表达体系、借助活细胞显微工作站，研究INMAP基因表达动态调控情况下细胞生命活动全过程；通过酵母双杂交等探讨INMAP的互作因子及调控机理；通过集落形成和裸鼠致瘤等试验，并对照肿瘤蛋白表达谱及标志基因，探究INMAP异常表达与细胞癌化等的关系，将INMAP的功能调节和相关的细胞增殖研究深化一步。

本项目深入到本组发现并进行过初步分析的纺锤体蛋白INMAP的功能调节中，揭示了其与细胞增殖及癌化的基本关系。通过Tet-Off可调基因表达体系，研究了INMAP表达调控下的细胞生命活动；通过酵母双杂交等探讨了INMAP的互作因子及调控机理；通过裸鼠致瘤等试验，探究了INMAP异常表达与细胞癌化等的关系，将INMAP功能调节和相关细胞增殖研究深化了一步。主要研究进展如下：.1. 建立了 INMAP 表达体系；进行了INMAP与细胞生理变化关系的探讨，获得了 pTRE-INMAP(-) 可调细胞株，发现 INMAP 表达量下调后细胞周期无明显改变，但周期相关蛋白 Cyclin E 和 P27的表达有下调趋势。.2. 运用酵母双杂交，得到 4种与INMAP互作的蛋白，对揭示INMAP活性分子形成、跨细胞器运输或特定靶向作用和与有丝分裂相关的功能机制具有重要意义。特别是INMAP与TATDN1间存在直接互作，异常表达的INMAP与TatDN1的互作可能关联着肿瘤。.3. 进行了INMAP的磷酸化预测，发现其特异定位序列中有 2 个关键磷酸化位点，并通过体外孵育发现 INMAP 具有有丝分裂器特异磷酸化现象；证明 M 期诱导的一族蛋白磷酸化（MPM-2反应）高峰是新形式的有丝分裂调节相关磷酸化，使我们对有丝分裂调控的理解提升了一步。.4. 抑制 INMAP后, HeLa细胞的纺锤体形成并未受明显影响，但着丝粒蛋白CENP-B在分布上呈现出 “halo”（风圈）模式；这种情况下CENP-B 80 kDa完整成分弱化了，而60 kDa变异成分则成显著成分，这表明INMAP可调节CENP-B的修饰，而且CENP-B 缺失会导致着丝粒组织异常。.5. 证明INMAP是一种新的POLR3B截断体，并在几种人类癌细胞中表达上调；INMAP 高表达抑制p53 和AP-1转录活性，且呈剂量依赖模式。这些结果说明，INMAP可能通过p53和 AP-1途径发挥功能, 这也表明了其活性与肿瘤发生的关联性。.6. 通过裸鼠成瘤实验发现，INMAP过表达对成瘤率、肿瘤生长和荷瘤裸鼠肝脏病变略有抑制。.综合以上研究结果可以认为，INMAP发挥双重功能——既通过纺锤体-着丝粒联系影响细胞命运决定及增殖状态，又通过其基因表达和重要调节通路协调有丝分裂动力学，并与肿瘤关联。相关研究值得继续深化。