纺锤体蛋白INMAP通过稳定CENP-B影响有丝分裂的机理研究

Centromere is a structure necessary for the replicated genomes to be equilibriously segregated. It regulates the traction power of the spindle to pull chromosomes to the opposite poles. CENP-B is a protein guaranteeing centromere assembly, and INMAP is a spindle protein. We have demonstrated that they may interact with each other. INMAP gene silencing may lead to the loss of the DNA binding domain of CENP-B and cell cycle phase changes. INMAP over expression leads to spindle defects, cell division arrest, and the formation of polycentrosomal and multinucleate cells etc. This project will use segmented protein binding strategy, by the methods such as Co-IP and Pull down, to reveal the precise functional position of INMAP on CENP-B; by use of proteases and their inhibitors, to analyse the stabilizing function of INMAP on CENP-B; by INMAP stably knocked down system and gene expressing chips, Real-Time RT-PCR, mass spectrometric sequencing and Western blot etc., to analyse the changes of mitotic regulation related factors caused by the alteration of the interaction between INMAP and CENP-B. With these efforts to deduce the function of INMAP through the regulation of CENP-B mediated centromere assembly. This study will make a contribution to mitotic regulatory mechanism, especially its new regulatory links.

着丝粒是细胞分裂中已复制染色体组均衡分离的必需结构，调控着纺锤体将染色体牵向两极的动力。CENP-B是保障着丝粒组装的蛋白，INMAP是一种纺锤体蛋白，我们已证明二者互作；INMAP基因沉默可能导致CENP-B断掉DNA结合域、细胞周期时相变化；INMAP过表达导致纺锤体缺陷、细胞分裂阻断、多中心体和多核等。本项目将利用分肽段结合策略，通过Co-IP、Pull down等方法揭示INMAP和CENP-B的具体作用部位；通过蛋白酶及其抑制剂分析INMAP对CENP-B的稳定作用；通过INMAP稳定敲降体系和基因表达芯片、Real-Time RT-PCR、质谱测序和Western blot等分析INMAP与CENP-B的互作改变所致有丝分裂调控相关因子的变化，综合推断INMAP借调节CENP-B介导的着丝粒组装发挥的功能。本研究将对有丝分裂调控机制、特别是其新调控环节的揭示作出贡献。

着丝粒是真核细胞中保障有丝分裂时染色体分离的结构和功能部件，是姐妹染色单体的联结纽带，通过其动粒结构直接附着微管，调控纺锤体牵引染色体的动力。前期研究表明，纺锤体蛋白INMAP的基因沉默可能导致CENP-B断掉DNA结合域和细胞周期时相变化；INMAP过表达导致纺锤体缺陷、细胞分裂阻断、多中心体和多核等。本项目利用分肽段分析策略，通过Co-IP、Pull down等方法揭示了INMAP和CENP-B的具体作用部位，结合蛋白酶抑制实验分析了INMAP对CENP-B的稳定作用；通过INMAP基因敲除和IncuCyte长时程动态活细胞成像、高内涵细胞成像、染色体畸变、流式细胞术分析和Real-Time Q-PCR、Western blot等技术，探讨了INMAP与CENP-B的互作改变所致细胞生长、有丝分裂变化，综合推断了INMAP借调节CENP-B介导的着丝粒组装发挥的功能及其调控通路。系列实验表明，在INMAP缺失的细胞中CENP-B不能结合到着丝粒，出现染色体畸变和微核，细胞生长缓慢，并在分裂期滞留；定量分析证明，敲除INMAP的细胞株内CENP-B的cDNA量与野生型无显著差异，说明CENP-B的断裂不是发生在RNA水平而是蛋白裂解的结果；蛋白互作结合蛋白酶抑制试验证明，催化CENP-B异常裂解的主要是糜蛋白酶；INMAP通过保护酶切点而对CENP-B的断裂抑制不需要第三因子介导，此酶解调节通过直接去留CENP-B的DNA 结合域，调控着丝粒/动粒中的蛋白-DNA复合结构，影响有丝分裂染色体的分离和基因组稳定。进一步研究表明，敲除INMAP基因导致细胞周期引擎激酶Cdk1调控因子CyclinB降解受阻，细胞长时间停滞于分裂期。这说明INMAP的缺失通过影响APC（后期促进复合体）/泛素-蛋白酶体激活途径，参与了细胞分裂调控。本研究有助于揭示新的有丝分裂调控环节。