艰难梭状芽胞杆菌肠毒素A对EV71优势抗原表位免疫原性的作用及机制研究

研究表明，艰难梭状芽胞杆菌肠毒素A具有免疫增强作用，但机制不明。本项目在前期研究的基础上，通过基因工程技术对已经构建的编码艰难梭状芽孢杆菌（Clostridium difficile， C.difficile）肠毒素蛋白A (Toxin A，TcdA)的质粒pHis1522：TcdA进行改造和重建。构建编码艰难梭状芽孢杆菌重组Toxin A的C末端（去除毒性区，保留跨膜区和受体结合区）和肠道病毒71型（EV71）的主要衣壳蛋白VP1质粒。将构建的表达质粒转化巨大芽孢杆菌原生质体，进行融合蛋白的表达、纯化和鉴定。使用该融合蛋白通过不同粘膜途径免疫小鼠，探讨艰难梭状芽孢杆菌 Toxin A对EV71 VP1优势抗原表位在小鼠免疫保护中的作用和可能机制，为EV71新型粘膜疫苗研究提供理论指导和研究方向。

本课题对EV71型手足口病疫苗的筛选评价进行了相关探讨，在巨大芽孢杆菌中重组表达了肠毒素A, 发现重组肠毒素具有很好的生物活性和高效表达水平。利用肠毒素A作为免疫佐剂作用，对EV71灭活疫苗、VP1重组蛋白疫苗、DNA疫苗进行了相关探索。1. 体外克隆表达了EV71的VP1、VP2、VP3、VP4蛋白，并以VP1为包被抗原开发研制了EV71的血清学诊断方法，在临床进行了推广应用。2. 在动物实验中发现VP1具有良好的免疫源性。3. Toxin A具有良好的免疫佐剂作用，其作用机制可能是通过诱导分泌性IgA产生、转化，并能够增强特异性T细胞也具有免疫增强作用。