激酶底物筛选新方法的研究

Reversible protein phosphorylation play important role in signal transduction. The specific interactions between kinases and their substrates form the complex phosphorylation network. Due to lacking of effective kinase substrate screening methods, the knowledge of the kinase substrate relationship is still superficial. One protein could be phosphorylated by different kinases at different residues. Therefore, it is crucial to determine the phosphorylation site for the kinase substrate relationship. The development of mass spectrometry-based proteomics paves the way to determine phosphorylation site in a high throughput way. We proposed a new proteomics approach to screen the kinase substrate relationship. In the approach, proteins in total cell lysate are first immobilized onto beads. The immobilized proteins are then incubated with kinase for in-vitro phosphorylation. The putative substrates, i.e. the phosphorylated proteins, and their phosphorylation sites are finally identified by proteomics approach. Because all the proteins are immobilized, the background phosphorylation resulted from the intrinsic kinases presented in the lysate is expected to be reduced significantly. With the accomplish of this project, an new proteomics approach is expected to be developed to screen the kinase substrate relationship and their phosphorylation sites in a high throughput way. In the mean time, the approach will be extended to decipher the relationship of other post-translational modification enzymes and their substrates.

蛋白质可逆的磷酸化是细胞信号转导的基础，激酶与底物蛋白质之间的特异性磷酸化相互作用构成了复杂的磷酸化调控网络。由于缺少有效的激酶底物筛选技术，人们对激酶与底物的对应关系知之甚少。一个蛋白质可以被多个激酶磷酸化，因此是多个激酶的底物，但是它们的作用位点即磷酸化位点往往是不同的，因此在确定激酶与底物对应关系的同时应确定磷酸化位点。基于质谱分析的磷酸化蛋白质组学的发展为通量化鉴定磷酸化位点创造了条件。本项目提出了一种将细胞提取物中的总蛋白质固载于固相微球上进行体外磷酸化，然后利用磷酸化蛋白质组学分析技术鉴定潜在的激酶底物蛋白及其磷酸化位点的新方法。在细胞提取物中的干扰激酶由于被固载在微球上而使其难以对其它蛋白质进行磷酸化，因此可以在一定程度上抑制背景磷酸化的影响。通过本项目的研究希望实现通量化鉴定激酶底物蛋白质及其作用磷酸化位点的目的，同时希望所建立的固相方法可以适用于其它修饰性酶底物的筛选。

本项目建立了多种激酶等修饰酶的底物筛选方法。针对目前利用合成肽段库确定激酶特异性的方法中肽段合成过程复杂、难以匹配真实的底物蛋白序列而影响底物蛋白的鉴定等问题，发展了一种基于蛋白质衍生化肽段库确定蛋白激酶特异性的定量方法。通过将体外激酶磷酸化、定量蛋白质组学以及规模化磷酸化位点数据库的应用相结合，建立了一个整合的磷酸化蛋白质组学分析流程，用于蛋白激酶CK2底物蛋白的规模化筛选。将该方法用于Jurkat 细胞中CK2激酶底物蛋白的鉴定，从581个蛋白质上面鉴定到了988个CK2激酶的潜在底物位点。通过与体内磷酸化位点数据库比对后，356个蛋白质的605个磷酸化位点被鉴定为CK2激酶的高可信度底物位点，这是迄今为止单次试验鉴定到CK2激酶潜在底物数目最多的一个数据集。发展了一种基于固相酶切反应的蛋白酶底物的体外筛选方法。该方法首先将蛋白裂解液中的蛋白质直接固载于固相载体上作为筛选库，然后加入蛋白酶进行特异性酶切反应，底物蛋白被酶切后产生的肽段释放进入溶液中，而非底物蛋白由于不能被酶切而完整的保留在固相载体上，通过离心分离即可得到底物蛋白的酶切肽段。待二次胰蛋白酶酶解后，采用定量蛋白质组学技术进行分析。该方法利用固相酶切反应，将底物蛋白的酶切肽段从大量的背景蛋白质中筛选出来，有效降低了样品的复杂性，而二次酶解产生的中间肽段又能辅助底物蛋白的鉴定，提高底物蛋白鉴定的可靠性与可信度。我们将该方法用于凋亡执行酶caspase-3的底物筛选，从人外周白血病细胞中筛选出1098个潜在的caspase-3底物蛋白，包含503个天冬氨酸酶切位点，其中CASBAH数据库已知的底物占所鉴定底物蛋白质的28.0%，这也是目前为止规模最大的caspase-3底物蛋白质数据集。这些方法的建立为阐释修饰酶与底物之间相互作用创造了条件。