原位诱导反应性星型胶质细胞增殖分化促进脊髓神经功能恢复的实验研究

脊髓损伤后，星型胶质细胞在形态和功能上出现变化，形成反应性星型胶质细胞（reactive astrocyte）。反应性星型胶质细胞具有减轻炎症反应、分泌神经营养因子及防止神经元退变等神经保护作用，同时还获得神经干细胞的自我更新及多向分化的能力，由于其数量巨大，如果能够通过其改善脊髓损伤后的内环境，减少其向星型胶质细胞分化，减少疤痕的产生，将对脊髓神经功能的恢复产生促进作用。本课题设计构建EGF（表皮生长因子）与CNTF（睫状神经营养因子）的慢病毒双表达载体。体外实验中将反应性星型胶质细胞进行体外培养并感染双表达载体，鉴定其增殖及多向分化能力。体内实验中制备大鼠T10脊髓损伤模型，局部灌注EGF和CNTF双表达慢病毒载体，通过鉴定反应性星型胶质细胞的数量及分化、分析局部的炎症反应及疤痕厚度，BBB评分判定脊髓神经功能的恢复，探讨原位诱导反应性星型胶质细胞增殖分化促进脊髓神经功能恢复的实验研究

本项目建立在反应性星形胶质细胞具备神经干细胞特点的理论基础上。课题组成员成功构建真核表达载体pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/hygro B-CNTF。脂质体介导重组真核表达载体转染cos-7细胞后，western blot法证实共转染后重组EGF、CNTF蛋白能够在cos-7细胞中稳定表达。在无菌条件下取出损伤处脊髓组织进行细胞培养，免疫荧光染色发现培养的细胞同时表达星形胶质细胞特异性标记物GFAP和神经干细胞特异性标记物nestin，证实分离培养出的细胞为星形胶质细胞源性，并具有神经干细胞的特性。细胞经诱导分化后可分化为神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞，证实分离培养出的细胞具有多向分化潜能。制备大鼠脊髓损伤模型后将pSecTag2/Hygro B-EGF、pSecTag2/hygro B-CNTF共转染至脊髓损伤处。大鼠分为EGF转染组（A组），CNTF转染组（B组），CNTF与EGF共转染组（C组）和对照组（D组）4组。BBB评分及Rivlin斜板运动试验均可见C组高于其他三组。HE染色可见C组治疗效果好，脊髓组织有大量新生神经元，炎性反应及瘢痕形成不明显，形态接近于正常脊髓组织。免疫荧光染色显示Nestin+/GFAP+细胞数目及nestin发光强度上升，表明具有神经干细胞特性的反应性星形胶质细胞数量及活性明显增加。这些研究结果表明，EGF和CNTF能够促进星形胶质细胞逆分化，从而促进损伤脊髓功能的修复。