利用连续光受激发射损耗显微技术研究细胞对多壁碳纳米管的摄取机制

碳纳米管作为一种重要的纳米材料，有望成为新一代的药物载体，从而在生物医学中发挥重要作用。由于碳纳米管尺度在光学衍射极限以内以及缺乏突破衍射极限的光学显微镜技术，导致其进入细胞的机制及胞内定位仍然存在争议，这方面的研究对显微系统的分辨率提出很高的要求。受激发射损耗显微术（STED）克服了衍射极限，是超分辨光学显微镜的典型代表，有可能为解决此纳米生物学的重要问题提供强有力的技术手段。本项目拟在商品化的激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）基础上发展一套操作简单，工作稳定，快速成像，适合实际生命科学研究的连续光受激发射损耗显微(CW-STED)成像系统，并实现其双色成像和三维超分辨成像功能。使用该系统对不同修饰的碳纳米管进入细胞的全过程，及其在细胞内的定位和转运过程进行高分辨可视化研究，能够帮助揭示碳纳米管和细胞相互作用的深层次机制，为其在生物医药领域的大规模使用奠定坚实的基础。

经过三年来的研究，本课题开展了连续光受激发射损耗显微镜（CW-STED）系统的研制，实现了突破光学衍射极限的70nm的分辨率，同时，利用该系统的超高分辨率，对细胞内碳纳米管的分布进行了高分辨可视化研究。首先，我们在商品化的激光扫描共聚焦荧光显微镜（LSCM）的基础上，成功建立起一套操作简单，工作稳定，快速成像，适合实际生命科学研究的连续光受激发射损耗显微镜。在这个过程中，设计了整套装置的光路，完成了损耗光系统的准直和整形，损耗光耦合进入显微镜的光学和机械元件的设计与加工，损耗光与激发光空间同步，中心零光强分布的损耗光焦斑模式的调节与探测，减小背景噪声的探测系统的调试，及系统正常工作的参数优化等过程。使用90nm金颗粒的扫描成像，实现中心零点光强（<7%）分布的损耗环形光斑，获得了激发光和损耗光焦斑在横向和纵向扫描的点扩散函数分布，数据表明两光斑基本重叠，横向上两焦斑中心相差约8nm，远小于20nm的实验允许误差范围。利用20nm大小的荧光小球和尺寸约6nm的DNA四面体对系统的分辨率进行了测量，将其与相同参数下对应的共聚焦成像图片进行了对比，表明该装置实现了突破光学衍射极限的超分辨成像，获得了70nm的超高分辨率，分辨能力是原共聚焦显微镜的4倍。此外，我们还发现使用偶联了Atto488-Atto540Q分子对的DNA探针标记的Hela细胞微管为样品，可实现CW-STED系统与饱和荧光共振能量转移显微镜（Saturated FRET microscopy，SFM）联用，进一步提高了系统分辨率。.借助于CW-STED系统的超高分辨率，在亚细胞层次上对进入细胞的碳纳米管的分布定位进行了研究，结果发现碳纳米管的分布是不均一的，明显富集在细胞核周围的细胞质基质中，并且是以不同程度的聚集状态存在的。碳纳米管通过网格蛋白依赖的内吞途径进入细胞的，超分辨图像中大小不一的荧光团就是碳管在内吞过程中形成的不同大小的泡状结构。