VWF分子A3区“front face”域基因突变对VWF蛋白代谢和功能的影响

血浆中的vWF，尤其是超大分子量vWF对调节人体内血栓与止血的动态平衡起着至关重要的作用，申请人在前期研究中发现：超大分子量vWF除了受vWF剪切酶Adamts13的调控外，还与自身分子结构密切相关。其中VWF A3区"front face"域某些氨基酸的突变将导致VWF分子对Adamts13异常敏感。为证实上述假设并深入研究VWF分子结构与功能的关系，本研究将选择"front face"域中可能的关键氨基酸位点进行点突变，在体外构建突变VWF的表达载体，在体外研究这些突变VWF的功能；同时将突变基因导入VWF基因敲除小鼠体内，观察转基因小鼠体内超大分子量VWF代谢和功能上的改变，从而在VWF层次上加深对血栓与止血调控的认识。

血栓形成性疾病是严重威胁人类健康的疾病之一，也是引起人类死亡的最常见疾病。血小板黏附到受损的血管壁上是血栓形成的第一步，在这一过程中，血管性血友病因子(von willebrand factor, vWF)起关键作用，它在血小板与内皮下基质（主要是各型胶原纤维）的相互黏附中起着桥梁作用，介导血小板粘附于血管损伤部位暴露的内皮下胶原。vWF是一种多结构域，多功能的多聚糖蛋白，它一方面通过自身的A1区与血小板膜受体GPⅠb-Ⅸ-Ⅴ复合物结合，另一方面通过其A3区与胶原结合。在正常情况下，VWF处于静息状态，并不与血小板发生反应。然而，在病理条件下如在动脉粥样斑块变狭窄或受损动脉部位，VWF-A3区与受损的内皮下胶原组织结合，在血流剪切力的作用下，VWF多聚体卷曲的空间结构被展开，使其相对保守的A1区暴露，并通过A1区与血小板膜表面糖蛋白GPIbα结合，使血小板发生粘附。然后通过一系列信号传递使血小板发生聚集，最终导致血栓形成。我们研制了1株特异性结合vWF A3区的单克隆抗体（mAb）—SZ-125，该抗体能特异性阻断vwfA1区与A3区之间的结合。在此基础上，我们运用免疫亲和质谱、肽段合成技术分析证实了，SZ125识别一段A3区线性抗原表位，即1001-EGGPSQIGDALGFAVR-1016，证实该肽段为vwfA1区与A3区相互作用的关键区域。我们利用氨基酸定点突变手段，精确定位了其中影响vwfA1区与A3区相互作用关键氨基酸为E1001、F1013、V1015、R1016。进一步在此基础上，我们构建了上述几个位点突变的vWF转基因小鼠，分析了各种转基因小鼠的表现型，证实E1001A、V1015A两种转基因小鼠的表现类似于人群中的2M型血管型血友病（VWD 2M）。上述研究从分子机制方面解释了部分A3区氨基酸位点在发挥VWF功能中的关键作用。