使用化学交联质谱和基因编辑技术解析“肝素钠合成体”的成分和组装

The anticoagulant heparin is a widely used lifesaving drug that enjoys an annual global sales of >10 billion USD. Isolated from the porcine intestine mucosa, heparin is one of the major biopharmaceutical exports of China. However, animal-derived heparin is an extremely complex mixture, which challenges the analysis and quality control of this anticoagulant drug. Scientists have been trying to produce recombinant heparin in CHO cells without success because the details of heparin biosynthesis are still unclear. In the recent study, we have used CRISPR/Cas9 based genome editing technology to deconstruct the biosynthetic pathways of glycosaminoglycans in CHO. We have in multiple cases found that the CHO biosynthetic enzymes of heparan sulfate have potential interactions with one another, which suggests the classical "GAGosome" hypothesis. Based on these prior results, we are proposing to directly isolate and dissect the components of the "GAGosome" related to the heparin production in mast cells. We hypothesize that the potentially unstable tertiary structures of "GAGosome" can be stabilized by cross-linking reagents, purified by affinity chromatography, and analysed by mass spectrometry. We also plan to extend our prior CRISPR/Cas9 based knockout studies to mast cell lines as a complementary method to cross-confirm the mass spectrometry results. Our study will uncover the necessary protein machinery for heparin production in mast cells and guide the future studies for recombinant heparin in engineering cells.

全球年销售额达到100亿美元的抗凝血药物肝素钠，是我国出口的主要生物大分子药物之一。然而这种从猪小肠肠衣粘膜提取出来的抗凝血药物却是极为复杂的高分子混合物，给分析和质量控制带来巨大挑战。由于至今未能全面解析肝素钠的生物合成路径，科学家们数次试图在工程细胞CHO里生产重组肝素钠却无功而返。申请人在过去三年的前期工作中，使用CRISPR/Cas9对CHO细胞中表达的所有参与糖胺聚糖生物合成的基因进行了系统的研究，发现多个肝素钠合成酶相互作用，间接印证学术界关于“糖胺聚糖合成体”的经典假说。在此基础上，本项目拟使用化学交联等质谱手段，直接分析小鼠肥大细胞中与肝素钠合成相关的“肝素钠合成体”的成分和组装，并结合CRISPR/Cas9基因编辑技术进行确认，目标得到肥大细胞生产肝素钠必需的蛋白部件，为未来探索在工程细胞内生产这一抗凝血药物奠定基础。

以肝素钠为代表的糖胺聚糖是具有广泛生物活性的复杂多糖。不同于蛋白质和核酸，糖胺聚糖的生物合成没有模板引导。“数十个生物合成酶是如何通过相互协作从而精准生成高度修饰的糖胺聚糖糖链？”是糖生物学领域多年来未能回答的科学问题。近年的研究表明，参与糖胺聚糖生物合成各个步骤的合成酶有可能组装成为“糖胺聚糖合成体”（GAGosome），然而相关证据有限。本项目基于课题组前期使用CRISPR/Cas9在CHO细胞中发现的糖胺聚糖合成酶之间的相互依赖关系，以“解析具有生物学意义的硫酸乙酰肝素GAGosome成分和组装”为总体目标，计划通过生化纯化和邻近标记，结合高分辨率质谱技术，印证学术界关于“糖胺聚糖合成体”的经典假说。.研究过程中，项目组克服新冠疫情影响，完成拟定研究目标，发现糖胺聚糖修饰酶复合物HS2ST1/GLCE影响糖链合成，在此基础上系统解析了关键糖胺聚糖合成酶HS2ST1、GLCE、EXT1和EXT2的“邻近蛋白组”，从而发现并验证了HS2ST1/GLCE复合物与EXT1/2复合物之间的物理相互作用，表明其可能共同参与了“糖胺聚糖合成体” 的组装。项目实施过程中，累计发表SCI论文三篇，获批国家专利一项。主要研究成果在陆续整理发表过程中。本项目的顺利实施，首次解析了硫酸乙酰肝素相关GAGosome的成分与组装，为未来调控其中各个合成酶的相互协作，进而生产具有生物活性的糖胺聚糖奠定了基础。