运用差异糖蛋白组学探索O-GalNAc糖基转移酶的特异性底物与功能

O-GalNAc glycosylation is one of the most common post-translational modifications (PTMs) of proteins. However, although O-GalNAc glycosylation sites are widely identified in membrane and secretory proteins, little is known about the site-specific functions of those sites. Using a CRISPR and high-resolution mass spectrometry based differential glycoproteomics approach, our recent research discovered that O-GalNAc glycosyltransferase 11 (GalNAc-T11) regulates the glycosylation and functions of a particular group of substrates and plays specific physiological and pathological roles in mouse models. The successful application of differential glycoproteomics to deconvolute the complex functions of O-GalNAc glycosylation set the stage for investigation of the isoform-specific substrates and functions of other members of the GalNAc-T family. In this proposal, we plan to select the Y-family O-GalNAc glycosyltranferases, a GalNAc-T subgroup characterized by distinct protein sequences, for further studies. We aim to establish knockout cell lines and mouse models, identify the isoform-specific substrates by differential glycoproteomics, and build the “functional glycoproteomics” for the Y-family GalNAc-Ts. The project, once finished, will lead to further progress of Glycobiology related sciences in China.

O-GalNAc糖基化是最为常见的蛋白翻译后修饰之一。细胞表面有数以万计的O-GalNAc糖基化位点，但目前尚不了解绝大多数位点所对应的生理生化功能。我们近期使用基于CRISPR和高分辨率质谱技术的差异糖蛋白质组学方法，开创性地发现决定O-GalNAc糖基化位点的GalNAc-T糖基转移酶家族之中，同工酶GalNAc-T11通过其特异识别的糖基化位点而调控专属的生理病理进程，展示了该方法的巨大潜力，从而打开了使用差异糖蛋白质组学方法研究O-GalNAc糖基化的新局面。在此基础上，拟选取代表性的Y-家族GalNAc-T糖基转移酶，建立细胞及动物层面的基因敲除模型，使用差异糖蛋白质组学方法对其特异性底物及功能进行探索性研究，为建立“O-GalNAc糖基化功能蛋白组”打下基础，推动糖生物化学相关领域的进一步发展。

分泌蛋白和膜蛋白的O-GalNAc糖基化修饰是多年来受到关注的重要蛋白翻译后修饰。然而，由于分析手段有限，生物学家对具体哪个蛋白的哪些糖基化位点参与生理和病理进程却了解有限。本项目以O-GalNAc糖基化修饰为化学出发点，以O-GalNAc糖基转移酶（GalNAc-T）的生化功能为生物突破口，计划通过发展基于CRISPR技术和现代质谱技术的差异糖蛋白组学分析方法，对GalNAc-T糖基转移酶家族的底物特异性和对应功能进行探索性研究。项目基于对GalNAc-T11的前期研究基础，研究目标包括“继续揭示GalNAc-T11催化的糖基化对LPR2等受体蛋白的功能调控”、“应用差异糖蛋白组学方法探索以Y-家族为例的代表性GalNAc-T的特异性底物”、“发现代表性GalNAc-T通过特异性底物介导的生物学意义和病理学功能”。.研究过程中，项目组克服新冠疫情影响，完成拟定研究目标，获得“建立pseudo-EThcD差异糖蛋白组学方法”、“发现GalNAc-T11通过特异性糖基化LRP2 受体蛋白调控其蛋白内吞功能的机制”、“使用差异糖蛋白组学解析GalNAc-T18底物鉴定数据集”等多项研究成果。同时，项目组面对疫情需要，积极进行新冠应急性增补研究，取得额外的研究成果：“发现抑制新冠spike蛋白激活的关键糖基化位点和相关机制”。项目累计发表SCI论文两篇，申请专利一项。主要研究成果还在陆续整理发表过程中。除此之外，作为“生物大分子动态修饰”重大研究计划培育项目，项目组在实施过程中，建立了“基于质谱的差异糖蛋白组学平台”、“基于CRISPR的GalNAc-T基因敲除细胞文库”、“基于悬浮细胞的GalNAc-T表达纯化平台”等多个研究O-GalNAc糖基化修饰的基础平台，从而达到本项目的“培育”目标，为未来全面研究GalNAc-T家族20个同工酶的生理和病理功能奠定基础。