关节软骨细胞mTOR通路响应不同强度机械刺激的作用和机制

Injurious articular mechanical stimulation is an important factor leading to chondrocyte apoptosis and cartilage matrix degeneration. Studies have shown a repression of cartilage degeneration progress subjected to inhibition of mTOR, through improving chondrocyte autophagy activity, inhibition of apoptosis and protecting cartilage matrix , suggesting that mTOR pathway is involved in the articular cartilage degeneration process. However, the mechanism of the dynamic regulation of cell death or survival through endogenous mTOR pathway by mechanical stimulation with different intensities is not clear. Since AKT and MAPK signaling pathways are two major upstream pathways of mTOR, and are both involved in the mechanochemical signaling pathway in chondrocytes. We conclude that mechanical stimulation with different intensities may regulate mTOR activity via MAPK and (or) Akt pathway, thereby regulate autophagy activity of chondrocytes and matrix metabolism. We intend to take advantage of our early established in vitro 3D dynamic loading culture of chondrocytes model and in vivo non-invasive mouse knee loading model, to investigate the response of mTOR pathway to mechanical stimulation with different intensities, to clarify the mechanism of the regulation of chondrocyte autophagy and cartilage matrix metabolism through mTOR pathway under different intensities of mechanical stimulation, and to provide a new theoretical basis for the issue that biomechanical stimulation induced cartilage degeneration.

损伤性关节机械刺激是导致软骨细胞凋亡及软骨基质退变的重要因素。有研究发现通过抑制mTOR活性，可提高软骨细胞自噬活性，抑制细胞凋亡，保护软骨基质，阻遏软骨退变进展，提示关节软骨内mTOR通路参与软骨退变进程。然而，对于不同强度的机械刺激条件下，内源性动态调节mTOR通路并最终调控细胞死亡或存活的机制尚不清楚。由于MAPK及AKT信号通路是mTOR的两条主要上游通路，并且均参与软骨细胞内机械化学信号传导。我们推论，不同强度的机械刺激可能通过MAPK和（或）Akt通路调节mTOR活性，进而调控软骨细胞的自噬活性和基质代谢。我们拟利用前期建立的软骨细胞体外三维培养加压模型和非侵入性体内小鼠膝关节机械压力损伤模型，研究mTOR通路对不同大小强度机械刺激的响应规律，阐明mTOR通路在不同强度机械刺激下，调控软骨细胞自噬以及软骨基质代谢的机制，为解决机械刺激因素引起的软骨退变这一难题提供新的理论基础。

本项目利用我们前期建立的软骨细胞体外三维培养加压模型和非侵入性体内小鼠膝关节机械压力损伤模型，研究膝关节软骨组织，内滑膜组织和软骨下骨组织对不同大小强度机械刺激的响应规律，并阐明mTOR通路在不同强度机械刺激下，调控软骨细胞自噬以及软骨基质代谢的机制。.对LGXSM-6 and LGXSM-33两种杂交小鼠进行了6N, 9N和12N的关节加压并于5, 9, 14, 28和 56 天观察关节软骨细胞、细胞外基质以及关节滑膜的变化。其中包括受压区域细胞外基质的丢失和分布模式改变、软骨细胞的凋亡、滑膜炎和异位骨化的产生以及软骨下骨的改变等。.其次，我们还应用该模型检测了一种商用透明质酸（HA）的治疗作用，并于临床常用的富血小板血浆（PRP）进行比较。我们给C57/BL6小鼠施与不同强度的膝关节加压，并于加压前或后不同时间点给予不同浓度的HA或者PRP进行治疗。结果显示，虽然HA联合PRP治疗能部分改善软骨下骨的退变，但是其效果与对照组并无统计学差异。HA联合PRP对关节创伤后关节炎的预防效果仍有待进一步研究。.我们还利用一个全新的纳米颗粒载体，对小鼠受损膝关节给予siRNA治疗，并探究了NF-kB通路在创伤后关节炎形成早期的作用机制（5）。我们的结果表明，早期给予NF-kB siRNA阻断该通路的激活，可以改变受损软骨细胞周围细胞内的AMPK、mTORC1和Wnt/B-catenin活性，促进细胞自噬、维持细胞内稳态及减少细胞凋亡，从而减缓或者阻止创伤后关节炎的发生和发展。.我们对细胞体外培养的胶体成分和制备工艺，尝试做出改进，分别测试不同程度的HA支链水凝胶的制备和实验，采用低温固化，化学固化和光固化技术制备工艺，检测水凝胶固化后机械强度和弹性模量。根据细胞-水凝胶复合物的组织切片染色和免疫组化研究，细胞体外生长良好。但新型水凝胶的RNA提取效率低下，影响了进一步的通路机制的研究。