人颊黏膜上皮干细胞诱导突变为癌干细胞模型的建立

"癌干细胞理论"中有关"癌干细胞究竟是由肿瘤细胞去分化还是成体干细胞恶性变而来"存在争论，缺乏直接证据。本研究通过转染hTERT获得永生化人颊黏膜上皮细胞，诱导其发生上皮-间充质转化(epithelial-mesenchymal transition, EMT），富集永生化成体干细胞，进一步转染H-RAS基因诱导其恶变为癌干细胞，建立上皮细胞→永生化上皮细胞→干细胞样永生化上皮细胞→癌干细胞四阶段致癌模型。该模型模拟成体干细胞转化为癌干细胞的过程，突出癌干细胞在肿瘤发生过程中的作用，课题为"癌干细胞由成体干细胞恶性变而来"假说提供了直接的实验依据，阐明肿瘤原发灶中首群癌干细胞起源的科学问题。课题设计引入EMT机制，可获得大量成体干细胞进行深入研究，课题前期研究：包括口腔颊黏膜干细胞分离和鉴定、上皮细胞永生化以及舌癌细胞EMT研究和癌干细胞分子标记筛选等，都为该课题的顺利开展奠定了扎实基础。

项目执行过程中，本课题组成功将hTERT转染原代培养的人颊黏膜上皮细胞，构建永生化人颊黏膜上皮细胞株hTERT+-OME（该部分实验内容已发表中文核心期刊1篇：陈之锋, 乔彬, 吕标, 郑超群, 胡逢春, 陶谦*. hTERT诱导永生化口腔黏膜上皮细胞株的建立. 中国口腔颌面外科杂志. 2013, 11(2): 91-96）。进一步检测发现，此细胞永生化过程中存在EMT/MET现象：二维培养时细胞呈现间质细胞表型，而三维培养下细胞自发MET，重获上皮细胞表型并获得成骨、成脂等多向分化潜能，这提示hTERT 本身即可能通过诱导细胞EMT，致其获得干细胞特征（该部分实验内容已发表SCI论文1篇，影响因子为3.60，Qiao B, Gopalan V, Chen Z, Smith RA, Tao Q*, Lam AK. Epithelial-mesenchymal transition and mesenchymal-epithelial transition are essential for the acquisition of stem cell properties in hTERT-immortalised oral epithelial cells. Biol cell, 2012, 104(8):476-489.）。三维培养条件不仅维持了永生化细胞的干细胞特性，而且使永生化细胞恢复上皮表型，从而突破项目计划中富集干细胞样永生化上皮细胞这一难关。因此课题组将原定TGF-β诱导方案调整为三维悬浮培养条件下转染H-RAS，诱导hTERT+-OME细胞球恶变为癌干细胞，目前已完成质粒构建、转染及克隆抗性筛选部分，筛选细胞的癌干细胞特性尚在进行中。此外，针对hTERT诱导细胞永生化过程中的EMT现象，本课题组进一步研究发现，BMI1(B lymphoma Mo-MLV insertion region 1 homolog)在此过程中行使重要功能，可能为hTERT诱导上皮永生化和EMT的关键作用因子（该部分实验内容已发表SCI论文1篇，影响因子为2.425，Qiao B, Chen Z, Hu F, Tao Q*, Lam AK. Activation of BMI-1 is essential in hTERT-induced immortalization and