粘蛋白Muc3SEA组件的自酶切机制及其生物学意义的研究

Muc3是肠柱状细胞膜上的重要粘蛋白，参与肠道粘液屏障和多种疾病发生，其羧基端两个EGF结构域之间有进化保守的SEA组件。前期研究发现SEA组件在LSKGSIVV基序存在酶切，并证实其是通过自酶切所致。但是该自酶切的发生机制及自酶切生物学意义目前不清。本课题提出如下假说并拟证实之：该自酶切是通过GSIVV丝氨酸上羟基对甘氨酸碳酰基上氧阴离子亲水攻击启动，自酶切基序构象机械张力过大诱发，SEA组件内其它基序调节自酶切的生化机制。比较表达野生型和自酶切阴性的Muc3羧基端的Lovo细胞的迁移能力、致凋亡情况、通过Muc3羧基端内EGF结构域激活其erbB-2表皮生长因子受体，及其它们对DSS诱导结肠炎粘膜溃疡的愈合作用的差别揭示该自酶切存在的价值。该研究对于揭示蛋白质自酶切发生的生化基础及分子机制、Muc3SEA组件进化保守的意义、跨膜性粘蛋白的功能、Muc3羧基端成为一个治疗靶点有重要意义。

背景和目的：在以前的研究中，我们证实rMuc3羧基端在LSKGSIVV基序的GS位点发生酶切。但酶切机制不清楚。探索酶切的机制及生物学意义有重要价值。方法：1、含目的蛋白原核表达载体的构建、表达；2、pQE30-Muc3(g/a)表达蛋白的纯化和体外孵育；3、SEA组件的完整性对酶切发生的影响；4、rMuc3SEA组件的分子模建；5、将不同酶切状况的真核表达载体稳定转染Lovo细胞，转染及表达鉴定后流式细胞仪观察转染后细胞G2/M比例及凋亡情况，划痕实验观察细胞在机械性损伤后迁移情况，Transwell小室实验观察细胞侵袭能力，以初步探讨酶切发生的可能的生物学意义。结果：1、获得原核表达载体，Western blotting检测发现表达产物在细菌中也如真核细胞中一样发生了酶切。2、原核表达蛋白纯化后37℃水浴孵育，N端30kDa片段是唯一的裂解片段，排除了rMuc3羧基端纯化蛋白降解的可能。3、将研究的rMuc3羧基端保守位点分别突变为终止密码子后，均可见大小约30kDa的酶切后片段。因此推测174－201的氨基酸序列对维持SEA组件的正常构象非常重要。4、模建的结构提示rMuc3SEA组件与人MUC1SEA组件的晶体结构非常相似，rMuc3羧基端SEA组件的分子模建为我们提供了理解rMuc3SEA组件自酶切发生的结构信息。5、rMuc3羧基端稳定转染人Lovo细胞后，流式细胞仪检测结果、侵袭小室实验、细胞划痕实验结果提示rMuc3SEA组件的自酶切可能掌控该蛋白功能的发挥。结论：1.在原核细胞表达水平和原核表达蛋白纯化后体外孵育水平均证实大鼠Muc3分子羧基端SEA组件发生酶切，结合前期在真核水平的研究结果和酶切位点的结构特点，表明该酶切的发生是没有蛋白酶介导的自酶切的结果。2. 应用定点突变技术研究SEA组件后续79个氨基酸对酶切的影响时发现羧基端174位丝氨酸至201位半胱氨酸之间的氨基酸序列对于酶切的发生非常重要。3．rMuc3SEA组件蛋白质分子模建的发现从结构上为我们提供了rMuc3SEA组件自酶切发生的必然性。4． rMuc3SEA组件的自酶切可能掌控其功能的发挥，在体外实验中能促进细胞增生，增强细胞迁移和侵袭，从而影响细胞的生物学行为。