α-突触核蛋白与Tau蛋白的相关性在METH所致神经毒性机制中的协同作用研究

In order to clarify the interaction and synergistic effect between α-synuclein and tau protein in METH-induced neurotoxicity, we plan to use gene knockout and RNAi technology to regulate the expression level of target protein in vitro and in vivo in this study. Based on our established molecular biological technique, molecular pathology, cell biological technique, ethology and so on, we will detect the total α-synuclein and tau protein, oligomers, protein phosphorylation, nitration and other related factors with or without METH treatment, observe their distribution, colocalization and composite-oligomers,and explore the effects on neurotoxic-related indicators including oxidative stress, mitochondrial damage, endoplasmic reticulum stress, apoptosis and synaptic remodeling and animal behavior caused by this interaction. We will also search the possible evidence of this two proteins spreading between neighboring neurons. This project will be helpful to clarify the molecular mechanism of α-synuclein and tau interaction in METH-induced neurotoxicity, and provide a richer theoretical basis for the therapy of drug addiction as well as the references for the related forensic molecular diagnosis and forensic toxicological mechanism.

为了进一步明确METH作用后神经退行性变标志蛋白α-SN与 tau 蛋白的相互关系及在神经毒性机制中所起的协同作用，在前期工作基础上，我们拟利用基因敲除和RNAi技术完全和非完全性去除其中一种蛋白的影响，在体内、外水平上利用分子生物学技术、分子病理技术、细胞生物学技术和动物行为学等技术研究METH作用后观察二者总表达量、寡聚体、磷酸化、硝基化及其相关因子的改变，观察二者分布、共定位表达及复合寡聚体的变化情况，探究其相互作用对氧化应激、线粒体损伤、内质网应激、细胞凋亡和突触重塑性等神经毒性损伤相关指标以及动物行为学的影响，阐明其协同作用在上述神经毒性机制中的重要功能，初步寻找其在相邻神经元间传播的佐证。希望通过本研究能够更深入了解α-SN和tau相互作用在METH神经毒性分子机制中所扮演的重要角色，为阐明其关键靶点作用和戒毒解毒研究提供基础，也为相关法医学分子诊断和毒理机制探讨提供参考。

为了进一步明确METH作用后神经退行性变标志蛋白α-syn与 tau 蛋白的相互关系及在神经毒性机制中所起的协同作用，在前期工作基础上，我们利用基因敲除和siRNA技术完全和非完全性降低其中一种蛋白的表达，在体内、外水平上，利用形态学方法、分子生物学技术、分子病理技术、细胞生物学技术和动物行为学等方法研究METH作用后观察两种蛋白的总量、寡聚体、蛋白磷酸化及其相关激酶的改变，观察二者分布、共定位表达及复合寡聚体的变化情况，探究两种蛋白在METH导致的神经退行性变中的重要作用。本研究发现，α-syn和tau蛋白在METH作用下存在正反馈机制，相互促进过表达和积累，蛋白间过表达恶性循环会增加METH诱导的神经毒性，而GSK-3β等磷酸激酶蛋白在此过程发挥了重要作用；METH可以影响Lamp-2a的表达水平从而影响CMA的活性，进一步抑制了α-syn的清除；METH作用后星形胶质细胞中发现P-α-syn，并且证明是由神经元通过外泌体等方式转移至星形胶质细胞中。METH导致的α-syn水平的升高与p-tau水平的升高分别以不同通路对神经元产生损伤。METH慢性处理可导致α-syn水平的升高。α-syn可产生直接损伤作用与间接损伤作用。直接损伤作用为α-syn直接进入线粒体导致线粒体肿胀及空泡化；进入少突胶质细胞导致髓鞘板层离散，形成髓鞘球样结构，轴突失去髓鞘保护裸露；在突触前终末积聚损伤突触囊泡融合与形成。间接损伤表现为α-syn也可以通过活化tau激酶GSK3，上调CDK5水平，导致tau磷酸化，tau磷酸化后导致其与轴突微管脱离，轴突微管稳定性降低从而导致微管解聚，细胞内物质运输受阻，形成的自噬体不能与溶酶体融合形成自噬溶酶体，自噬受阻，胞内异常蛋白质及细胞器自噬受阻，产生细胞毒性，最终产生神经退行性病变；同时， METH作用后P-α-syn转移至星形胶质细胞中，诱发星形胶质细胞的炎症反应。本研究证明了METH作用后α-syn与tau蛋白的相互关系以及在METH所致神经毒性机制中有相互促进的作用，相关研究结果为阐明其关键靶点作用和成瘾戒断治疗研究提供基础，也为相关法医学分子诊断和法医毒理机制探讨提供参考。