METH致α-突触核蛋白异常聚集的分子机制及其对氧化应激等神经毒性作用的影响

The results from the previous fund supported by NSCF (No.81072506) had verified that a-SN played key roles in the neurotoxicity such as oxide stress and damage of mitochondria by METH and literature data suggested that abnormal accumulation of a-SN would be contributed to its function of toxicity. So, we proposed a hypothesis that abnormal accumulation of a-SN would lead to neurotoxicity after METH-treatment. To explore the molecular mechanism and its functions of neurotoxicity, in vitro and in vivo methods and technologies including molecular biology, neural biology and molecular pathology will be used to study the effect on formation of a-SN oligomer after a-SN phosphorylation, nitration and SUMO by METH. The expression of Parkin, CHIP and UCH-L1 during UPP will be detected in the transcription and translation level and modulation of these factors expression will be evaluated for roles of a-SN accumulation which contribute to neurotoxicity of oxide stress. The aims of this study are to elucidate the functions on neurotoxicity of a-SN abnormal accumulation and provide foundation for looking for a new target for forensic medical diagnosis and new drug for patient with METH.

在研基金项目（No. 81072506）研究结果证明α-SN在METH所致的氧化应激、线粒体功能损害等神经毒性作用中具有关键作用，查阅文献推测该蛋白的异常聚集是其发挥毒性作用的重要形式，为了阐明α-突触核蛋白异常聚集的分子机制，证明其毒性作用，本研究拟通过体内外实验，用分子生物学、神经生物学、分子病理学等技术，并通过特异性抑制剂研究METH作用后α-SN的磷酸化、硝基化和SUMO化修饰对其寡聚体形成的影响作用，探讨对METH神经毒性作用的影响；在转录和翻译水平上观察UPP中Parkin、CHIP和UCH- L1的表达情况，并通过调控上述因子的表达，研究对α-SN的异常聚集的关键作用并探讨对氧化应激等神经毒性作用的影响，进一步阐明METH作用后α-SN是否通过异常聚集发挥其毒性作用，为法医病理诊断和寻找药物靶点奠定良好基础。

前期研究发现METH作用后α-突触核蛋白（α-syn）在多巴胺代谢障碍、氧化应激、线粒体损伤和细胞凋亡等方面有重要作用，并且查阅文献推测与其异常聚集相关。为了进一步证明METH作用后α-syn异常聚集的分子机制及其神经毒性作用，本研究在体内外水平上，通过特异性抑制剂、激动剂、RNA干扰、过表达和定点突变等调控手段，利用分子生物学、病理学和免疫学等技术，利用α-syn寡聚体特异性抗体5G4，研究METH作用后α-syn的硝基化、磷酸化对其寡聚体形成的影响作用，研究α-syn的SUMO化修饰、UPP中Parkin、CHIP和UCH- L1的表达变化以及二硫键异构酶（PDI）的硝基化对α-syn降解途径的阻滞作用，以及对细胞凋亡等神经毒性损伤的影响。结果发现，METH作用后α-syn表达增加，呈现明显的聚集体状态，α-syn硝基化水平呈上升趋势，并且呈现聚集状态，而使用NOS抑制剂L-NNA能够有效抑制N-α-syn表达，α-syn表达和聚集体随之呈现下降趋势，并且也缓解了METH导致的凋亡水平的上升和 DA水平的降低；METH作用后α-syn磷酸化作用增强，采用PLK抑制剂BI2536和沉默PPP2R1a基因均显著降低pS129 α-syn水平，使得METH导致的α-syn聚集状态得到缓解，线粒体膜电位升高，细胞凋亡也显著减少；METH作用后E2结合酶UBC9降低引起α-syn 类泛素化水平下降，突变α-syn与SUMO-1结合位点，特异性抑制α-syn 类泛素化，发现不仅加剧METH导致的α-syn异常聚集，还导致α-syn降解途径障碍；UPP相关因子仅有E3泛素连接酶Parkin表达水平下降，蛋白酶体活性随之降低，α-syn降解发生障碍；METH可诱导细胞产生氧化应激使得PDI发生S 亚硝基化而无法抑制α-syn的聚集，聚集的α-syn使得细胞毒性增强，促进细胞凋亡。上述结果证实METH作用后α-syn发生异常聚集是产生神经毒性损害的重要因素，但是其异常聚集的分子机制比较复杂，应该是多种因素形成一个复杂的网络调控所致，并且结果也进一步证明了METH可以导致中枢神经发生神经退行性改变，相关研究结果对于阐明新型毒品METH的神经毒理机制奠定了良好基础，并且为吸食METH相关的法医病理学诊断和解毒戒毒研究提供了明确的方向和理论基础。