滋补肝肾法调控黑素细胞氧化损伤致凋亡线粒体通路的研究

Oxidative stress cause the vitiligo, but the mechanism is unclear.Many studies have found that patients with vitiligo may have phenomenon such melanocytes apoptosis and mitochondrial damage, so we put forward the hypothesis that oxidative stress could lead to to vitiligo by mitochondrial pathway ..The prescription of nourishing liver and kidney is an effective prescription of vitiligon from Beijing Chinese Medicine Hospital. .This subject is melanocytes of apoptosis induced by hydrogen peroxide ,to explore whether oxidative stress lead to melanocytes apoptosis by mitochondrial pathway, to research mechanisms of the prescription of nourishing liver and kidney from the mitochondrial signal transduction pathway by probing into the influence on apoptosis melanocytes and calcium homeostasis in melanocytes, provide the scientific basis for the clinical treatment of vitiligo.

氧化应激导致白癜风发生，但是机制并不清楚，许多研究发现白癜风患者存在黑素细胞凋亡，线粒体损伤等现象，由此我们提出假设氧化应激可能通过线粒体通路引起黑素细胞凋亡进而导致了白癜风发生。滋补肝肾方以滋补肝肾为立法，是北京中医医院治疗白癜风的有效方剂。本课题以过氧化氢诱导黑素细胞凋亡模型为研究对象，观察该方及拆方的含药血清及主要成分对黑素细胞氧化损伤致黑素细胞凋亡、细胞内钙稳态、线粒体跨膜电位以及凋亡蛋白等的影响；探索氧化应激是否通过线粒体通路引起黑素细胞凋亡，该方是否作用于线粒体信号转导通路来调控氧化损伤引起的黑素细胞凋亡，揭示滋补肝肾治则的作用环节，为临床治疗白癜风提供科学依据。

滋补肝肾方能够治疗白癜风，因为线粒体介导的黑素细胞凋亡通路是白癜风发病的重要条件之一，本课题以此为切入点，重点探讨滋补肝肾方全方、组方以及芍药苷对线粒体介导的小鼠黑素细胞在过氧化氢诱导下凋亡的影响，来解释滋补肝肾方治疗白癜风作用机制和靶点。通过滋补肝肾方和芍药苷预保护小鼠B16黑素细胞24小时后，用过氧化氢作用4小时造成细胞凋亡模型，观察其对黑素细胞的保护作用。实验一共分为四组，正常细胞对照组；过氧化氢损伤模型组；滋补肝肾方保护组和芍药苷保护组。实验二以拆方与全方组(高、中、低三个浓度)作对比，通过MTT法检测细胞活性、流式细胞仪检测细胞凋亡、Hoechst33342观察凋亡细胞的核变化、通过激光共聚焦显微镜JC-1染色法观察B16细胞线粒体膜电位。Western blot法检测8种细胞凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax 、Cyto-c、AIF、Smac、Cleaved Caspase-3的表达差异。通过Real-time PCR法检测各组细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax 、Cyto-c、AIF、Smac、Apaf-1等8个基因的相对表达。.结果发现通过滋补肝肾方和芍药苷预保护小鼠B16黑素细胞24小时后，用过氧化氢作用4小时造成细胞凋亡模型，在MTT法检测细胞活性、流式细胞仪观察细胞凋亡、Hoechst33342观察凋亡细胞的核变化、激光共聚焦显微镜JC-1染色法观察B16细胞线粒体膜电位检测中，模型组细胞活性均最低，对照组活性最高，全方组和芍药组细胞活性居中，其中细胞活性比较有显著的统计学差异（p〈0.01）。Western blot法检测的8种凋亡相关蛋白Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax 、Cyto-c、AIF、Smac、Cleaved Caspase-3的表达和Real-time PCR法检测各组细胞中Caspase-3、Caspase-9、Bcl-2、Bax 、Cyto-c、AIF、Smac、Apaf-1等8个基因的相对表达结果显示，四组间有明显差异，全方组抗凋亡效果最好，模型组凋亡发生的各项指标明显升高，对照组指标最低。拆方组表示：滋补肝肾方对钙离子稳态有影响，可以减轻细胞损伤，对抗凋亡，全方组对细胞活力影响最为明显。可减轻免疫损伤。