羊口疮病毒ORFV118蛋白调控宿主细胞凋亡的分子机制研究

Apoptosis is one of the important roles of the host cell defense against viral infection. Our recent studies have found that sheep contagious pustular virus, orf virus (ORFV) encoded a novel protein, and called ORFV118 can inhibit host cell apoptosis and associate with the viral virulence. However, the exact molecular mechanisms are poorly understood. In the proposed study, we will utilize the microarray analysis, apoptotic protein microarray technology, yeast two-hybrid system, co-immunoprecipitation experiments (Co-IP) and flow cytometry to investigate the exact molecular mechanisms of ORFV118, and the role of ORFV118 in host pathogenesis. Specific aim 1: Determine the molecular mechanisms by which ORFV118 regulates apoptosis process. Aim 2: Identify the molecules between ORFV118 and host cells interaction. Aim 3: Determine the role of ORFV118 in virulence and pathogenesis in the natural host. Given that apoptosis is one of the fundamental defensive roles in host cell against viral infection and that ORFV118 is novel, this work is likely to have broad application in further defining cellular apoptosis pathway responses to viral infection and identifying critical junctures in this pathway, therefore, opening to viral manipulation and possible prophylactic-therapeutic intervention. A better understanding of novel viral immunomodulatory function and host responses in the skin may suggest new strategies potentially involving improved vaccines and adjuvant for controlling viral and other diseases.

细胞凋亡是宿主细胞对抗病毒感染的重要防御机制之一。近期研究发现羊口疮病毒(ORFV)的新基因ORFV118具有抑制宿主细胞凋亡的作用，并与病毒的毒力相关，但其具体调控机制尚不清楚。本研究拟首先采用流式细胞术、Western blot等方法明确ORFV118对细胞凋亡的影响；再通过微阵列分析、细胞凋亡蛋白膜芯片筛选、capspase活性检测实验分别从基因、蛋白和酶活性水平探索ORFV118调控宿主细胞凋亡的可能途径；并通过蛋白酶激活实验、Western blot检测细胞凋亡相关蛋白、酵母双杂交筛选、免疫共沉淀（Co-IP）和激光共聚焦荧光显微镜等方法阐明ORFV118抑制凋亡的分子机制；最后，用118缺陷病毒NA1/11Δ118感染动物，以观察ORFV118基因在病毒致病机制、病毒毒力以及调节宿主免疫应答和炎症反应中的作用。本研究结果将为ORFV的发病机制、免疫机理以及疾病控制提供理论依据。

细胞凋亡是宿主细胞对抗病毒感染的重要防御机制之一。前期研究发现羊传染性脓疱病毒(ORFV)基因ORFV118编码的蛋白可能参与宿主细胞凋亡的调控，具体调控的分子机制不明。本研究探索ORFV118蛋白的分子特征和其参与宿主细胞凋亡的调控机制。研究发现：ORFV118为病毒编码的早期基因，ORFV独有，在副痘病毒外没有发现同源物。编码蛋白ORFV118由221个氨基酸组成的，分子量为24.8kDa。ORFV118蛋白定位于细胞浆和核内，缺失ORFV118的重组毒株不影响其入侵宿主细胞并复制， 也不影响宿主细胞周期，但抑制细胞凋亡。ORFV118主要抑制caspase-3、caspase-9、PARP剪切体蛋白表达量，而对caspase8的表达及Bcl2/Bax的比值影响较小，提示ORFV118通过抑制caspase9剪切体表达参与线粒体途径的细胞凋亡调控。ORFV118蛋白的31-58aa（富含精氨酸和甘氨酸）和177-221aa（含PARKRNG结构域）是ORFV118发挥抗凋亡作用的关键功能区，两段氨基酸序列缺失均影响ORFV118的核定位以及抗凋亡作用，尤其177aa-221aa缺失几乎使ORFV118功能完全丧失。动物试验结果证实 ORFV118是ORFV 的一个新毒力因子，缺失ORFV18的毒株其毒力减低及患羊病理表现明显减弱。另外，本课题初步探索了ORFV对乳腺癌细胞的溶瘤潜力，发现ORFV可在5种不同乳腺癌细胞系中复制增殖，并降低肿瘤细胞的生存率；在乳腺癌鼠4T1移植瘤模型中，ORFV治疗组的瘤体体积明显小于对照组。ORFV118缺陷株表现出比野生株更强的肿瘤细胞杀伤作用，提示ORFV118蛋白有可能成为提高ORFV溶瘤效果的潜在靶点。采用CRISPR/Cas 9激酶敲除文库筛选到影响ORFV溶瘤效率的宿主激酶：MST1R、PAK4、DAPK1、SGK3等，并进一步验证PAK4激酶的作用。沉默PAK4激酶的表达可提高ORFV在乳腺癌细胞中的感染、复制能力及诱导其凋亡的能力。ORFV与PAK4抑制剂联用能有效增强对乳腺癌细胞生长的抑制能力。本研究鉴定出一种新的具有抑制宿主细胞凋亡的ORFV免疫调节蛋白，为ORFV病毒的防控和治疗提供新的疫苗和佐剂靶标；并探索了ORFV的溶瘤潜能，为新型ORFV溶瘤病毒载体的研制和改造提供了新思路。