基于双分子互补的细菌动态蛋白相互作用网络技术研究

本项目针对当前动态蛋白相互作用研究的技术瓶颈，利用细菌荧光素酶的独特优势，克服现有真核生物荧光素酶双分子互补系统在实时动态检测方面的缺陷，构建拥有完全自主知识产权、基于细菌荧光素酶的高通量活细胞实时动态双分子互补蛋白相互作用检测系统；进一步利用此系统，以研究基础较好的细菌鞭毛系统为研究对象，通过遗传操作实现在最接近细胞生理状态的情况下检测鞭毛系统蛋白相互作用的时序性和竞争性动态表达，从而构建鞭毛系统动态蛋白相互作用网络，并结合活细胞实时动态基因表达分析、动态蛋白相互作用干扰等技术对鞭毛系统调控蛋白FlgM的动态调控机制进行深入分析。通过本项目的实施，一方面可建立一种对蛋白质功能研究有重要促进意义的高通量活细胞实时动态蛋白相互作用检测新技术，另一方面可为大规模动态蛋白相互作用网络研究进行前期探索和技术储备，并努力实现从跟踪学科前沿转变为争取引领学科前沿的原创意义上的大胆探索和技术革新。

本项目针对当前微生物动态蛋白相互作用研究的技术瓶颈，利用细菌荧光素酶的独特优势，以生物发光共振能量转移理论为基石，构建了一个新的拥有完全自主知识产权的活细胞实时动态蛋白相互作用检测系统，并用FKBP-FRB以及鞭毛系统结构蛋白和调控蛋白的可逆动态相互作用对该系统进行验证，表明该系统除了可实现活细胞实时动态蛋白相互作用检测外，还可实现蛋白相互作用检测的可视化，以及用于蛋白相互作用抑制剂的筛选及抑制常数测定；进一步我们构建了围绕细菌鞭毛系统调控蛋白FlgM的动态蛋白相互作用网络，根据鞭毛合成过程中这些蛋白相互作用的动态变化，揭示了细菌鞭毛系统基因表达的关闭机制，并提出了一个新的基于蛋白动态相互作用的细菌鞭毛系统基因表达调控模型，该模型合理解释和完善了当前对细菌鞭毛系统调控机制认识的一些空白，并为进一步揭示鞭毛系统的复杂调控机制提出了可行途径。鉴于动态蛋白相互作用研究的重要性，我们将在以后的工作中继续完善我们发明的基于细菌荧光素酶的活细胞实时动态蛋白相互作用检测系统，不断提高其灵敏性和通量，并扩大其使用范围。