新型国产光敏剂叶绿酸f治疗膀胱癌的体外机理研究

Photodynamic therapy(PDT) is a novel cancer therapy, and PDT has been approved in bladder cancer treatment.It overcomes many disadvantages which appeared in conventional TURP treatment, such as the cancer residual, higher recurrence and necessary radical cystectomy in some patients. PDT is expected to become the ideal treatment in superficial bladder cancer, especially carcinoma in situ. Photosensitizer(PS) is the key component of PDT. Phtotfrin, the first genaration of PS, is a compound with drawbacks of higher price and phototoxicity after PDT. We have developed a second generation PS-CDHS801 in previous project. It has advantages such as excellent effect, low phototoxicity and lower price, but it is still not pure chemical. Now we have developmented a novel PS-chlorophyllin f with 97％ purity. In preliminary research, we found the chlorophyllin f has many characteristics such as chemical stability, better photoactivate, higher ratio in tumor/normal tissue, faster clearence and without photopathy. But the mechanism of chllorin f killing cancer cells was unclear.In this study we will clarify the subcellular location and killing mechanism of chlorophyllin f(such as inducing apoptosis or autophagy), and will significantly promote the research and development of novel independent intellectual property PS.

光动力治疗（PDT）是新兴起的一种肿瘤疗法，国外已批准用于治疗膀胱癌。它克服了常规电切治疗无法彻底清除癌细胞、复发率高、部分患者须切除膀胱的缺点，有望成为浅表性膀胱癌、尤其是原位癌的理想疗法。PDT治疗关键在于光敏剂。国外已上市第一代光敏剂Photofrin有非化学纯品、价格昂贵和光毒性大治疗后需长时间避光的缺点。前期研究了自主研发的第二代光敏剂CDHS801，它具有疗效肯定、光毒性低、价格便宜的优点。但它不是化学纯品。为此重新研发了纯度达97%的光敏剂叶绿酸f。初步研究发现叶绿酸f具有化学性质稳定、光敏化力强、肿瘤/正常组织分布比高、不易潴留无需避光的优点，比CDHS801更接近理想光敏剂的要求。但其杀灭癌细胞机制不详。光敏剂的亚细胞定位及是否诱导癌细胞凋亡或自噬对光敏剂的研发至关重要，本课题旨在探讨叶绿酸f亚细胞定位及是否诱导癌细胞凋亡或自噬，对具有自主知识产权国产光敏剂研发意义重大。

在本研究中，我们主要探索国产光敏剂叶绿酸f介导的光动力治疗对于膀胱癌的治疗效果以及其可能机制。首先，我们采用MTT法摸索叶绿酸f对于5637和T24细胞的最佳治疗浓度，结果发现在650nm激光激发100s后，对于5637细胞叶绿酸f的有效浓度为5ug/ml，而对于T24细胞，其浓度则为10ug/ml。在该浓度下，叶绿酸f介导的光动力治疗对于两种细胞的杀伤率分别达到86.51 和 84.88%，这表明叶绿酸f是一种很有效的光敏剂，其介导的光动力治疗对于膀胱癌具有很好的治疗效果。流式细胞术提示叶绿酸f介导的光动力治疗在5637和T24细胞中分别诱导50.61±1.66% 和54.3±1.32%的凋亡率，共聚焦结果提示叶绿酸f4小时后可进入线粒体，这进一步证明叶绿酸f介导的光动力治疗可诱导膀胱癌细胞发生凋亡，凋亡是其杀伤膀胱癌细胞的一种重要机制。接下来，我们检测经过叶绿酸f介导的光动力治疗后两种细胞中LC3及Beclin1蛋白的表达变化，结果发现PDT治疗后半小时，两种细胞中LC3II/LC3I开始明显增高，而Beclin1蛋白的表达量则从PDT治疗后1小时开始明显增加。Cyto-ID® Green autophagy dye染色则发现PDT治疗后1小时两种细胞中自噬颗粒明显增加，MDC及AO阳性颗粒分别于PDT治疗后2小时及4小时开始明显增加。电镜结果也提示PDT治疗后1小时两种细胞中自噬体明显增加，共聚焦结果提示叶绿酸f2小时后进入溶酶体，这些结果表明叶绿酸f介导的光动力治疗可诱导膀胱癌细胞发生自噬，自噬与叶绿酸f介导的PDT杀伤膀胱癌细胞密切相关。最后，我们预先加入自噬抑制剂3-MA，然后观察叶绿酸f介导的光动力治疗对膀胱癌细胞的杀伤能力的变化，结果发现其对5637和T24细胞的杀伤率分别为93.52%，95.51%；同时两种细胞的凋亡率分别为69.45±2.14%，77.69±1.75%，差异均有显著性意义，这表明抑制自噬可促进叶绿酸f介导的PDT对膀胱癌细胞的杀伤作用以及诱导的凋亡。这提示我们在临床上联用自噬抑制剂以及叶绿酸f介导的PDT可能是一种新的有效的治疗膀胱癌的治疗方法。