核糖体RNA甲基转移酶催化不同类型底物 (RNA/核糖体亚基)的碱基甲基化分子机理研究

Methylation of ribosomal RNA (rRNA) nucleotides plays an important role in the biogenesis and regulation of the ribosome in all living organisms. Bases methylation of rRNA is a common type of modification closely associated with fine-tuning the process of protein synthesis and bacterial resistance to antibiotics. There are distinct substrate patterns in different RNA methyltransferases (MTases): some MTases can only recognize ribosome subunits while some can only protein-free RNA. This difference most likely result from their different structures and different modified nucleotides, and thus brings about different catalyzing mechanisms, although there were a few studies on the structures of MTases in complex with their substrate RNA. In this research, the MTases RlmG (m2G1835), RsmH (m4C1402) and RsmE (m3U1498) are applied as our objects of study, as they catalyze the rRNA methylation from different types of substrates during different stages of ribosome assembly, and we plan to solve their crystal structures in complex with the substrates (RNA or ribosome subunits) and AdoMet. On this basis, the in vivo and in vitro MTase activities of a series of mutants and their interactions with the substrates will be further studied.This study will systematically demonstrate the detail mechanisms of base methylation in different nucleotides of rRNA catalyzed by the MTases with different substrate-recognizing patterns, and its implications for some important physiological processes such as protein synthesis and resistance. Now, we have solved the high resolution structures of the three MTases, providing the basis for further studies on the structures and function of their complexes.

核糖体RNA的甲基化对核糖体的生物合成和活性具有重要的调节作用，其中碱基甲基化是常见的修饰类型，与细胞内蛋白表达调控以及细菌耐药性密切相关。RNA甲基转移酶底物特异性的明显差异以及修饰核苷酸位点的不同决定了它们具有不同的底物识别机制。本研究选取不同底物识别类型的三种甲基转移酶RlmG(m2G1835)、RsmH(m4C1402)和RsmE(m3U1498)作为研究对象，它们作用于核糖体装配的不同阶段，利用蛋白质晶体学方法解析它们与底物 (RNA或核糖体亚基)及甲基供体的三元复合物晶体结构。在此基础上，将深入探索蛋白突变体在体内和体外的甲基转移酶活性及与底物的相互作用，在核糖体水平上系统的阐明作用于核糖体装配不同阶段的RNA甲基转移酶识别底物碱基上特异位点的机理,以及这些修饰如何影响蛋白合成等重要生理过程。目前我们已解析了这三种酶的高分辨率晶体结构，为研究复合物结构与功能奠定了基础。

甲基转移酶催化的核糖体RNA (rRNA)甲基化对核糖体的生物合成和活性具有重要的调节作用，与细胞内蛋白表达调控、30S亚基的组装及细菌耐药性等生理过程密切相关。在本项目中，我们选择了核糖体RNA甲基转移酶RsmE (16S rRNA m3U1498), RsmH/RsmI (16S rRNA m4Cm1402) and RlmG (23S rRNA m2G1835)作为研究对象，它们具有明显的底物特异性差异并作用于核糖体装配的不同阶段。我们利用X-射线晶体学方法获得了它们的单体或者与甲基供体AdoMet复合物和模拟底物的高分辨率结构，并采用了定点突变、与底物的复合物结构模拟和甲基转移酶活性测定等方法来研究它们如何识别AdoMet 并作用于底物的特异位点的不同的分子机制。RsmE在溶液中形成具有较强柔性的二聚体构象，这种构象对底物RNA的识别和结合有重要作用，只有一个AdoMet能与RsmE二聚体结合。通过分子模拟方法构建的RsmE-AdoMet-UMP三元复合物模型表明，二聚体中一个亚基的具有三叶草形的纽结的C端结构域负责结合AdoMet并催化反应，另一个亚基的N端结构域负责底物识别。RsmE催化的反应是由它的两个单体密切协作完成的，这种二聚化对保持它的活性是必需的。RlmG是由两个同源的N端结构域 (NTD) 和C端结构域 (CTD)串联而成。凝胶迁移电泳实验表明，全长和NTD能有效地结合底物RNA，而CTD不能结合RNA。通过分子模拟方法构建了RlmG-AdoMet-rRNA三元复合物的模型，反应前后底物RNA的构象会发生明显的变化, rRNA会首先解旋成单链构象，随后靶标G1835滑进活性位点。rRNA位于两个结构域形成的凹槽中间，结合在主要由NTD形成的正电荷区域。NTD在RNA的识别和结合过程中起主导作用，而CTD负责结合AdoMet并催化甲基化反应，该反应由两个同源结构域合作完成的。RsmI由N端结构域 (NTD) 和C端结构域 (CTD)组成，这两个结构域没有结构同源性。RsmI的活性状态为二聚体，两个单体采用“背对背”方式结合，AdoMet暴露在外边。在该复合物中，AdoMet结合在NTD和CTD组成的一个深口袋中，与周围的残基通过大量的氢键和疏水作用实现特异性结合，并且该口袋周围主要以负电荷为主。通过分子模拟方法构建了RsmI-AdoMet-rR