响应乙烯影响月季花瓣扩展的重要转录因子的筛选和功能分析

月季是全球第一大切花，乙烯是影响花朵开放的关键因素。已经明确，乙烯可抑制花瓣吸水扩展，导致僵花、僵蕾，严重影响开放质量。但是，乙烯影响花瓣扩展的转录调节机理尚不明确。筛选和鉴定乙烯下游、参与月季花瓣扩展调节的重要转录因子便成为解析转录调节机理的一个重要课题。申请者已经通过芯片技术，从15000个月季乙烯响应基因中，筛选到1032个早期响应基因，其中包括41个转录因子。通过RT-PCR验证，初选出13个响应乙烯、与月季花瓣扩展关系密切的基因。本课题将通过拟南芥过表达和月季体内的基因沉默和过表达技术对候选基因的功能进行鉴定；开展转录因子生化特性和转录激活能力分析；通过Microarray筛选目标转录因子下游的调节基因，确定其调节作用机制。本研究旨在通过乙烯调节月季花瓣扩展中重要转录因子功能的解析，力图了解乙烯调节月季花朵开放和花瓣扩展的转录调节机制，同时为月季品质改良分子育种提供基因储备。

通过454测序技术建立了月季花朵转录组数据库，包括60994个unitranscripts；通过Illumina测序技术建立了月季花瓣Small RNA数据库，从中鉴定出中33个保守的miRNAs家族，以及47个新的miRNAs家族。. 基于芯片分析，初步筛选到2,189个响应乙烯的unitranscripts，并对其中的RhGAI1、RhNAC3等多个转录因子基因进行了详细的功能分析，为进一步明确乙烯调控的月季花朵开放分子机理奠定了良好的基础。. 研究发现，乙烯对月季花瓣中表皮细胞扩展的抑制部分是通过一个生长抑制子RhGAI1介导的。乙烯诱导了RhGAI1的表达，而乙烯抑制剂1-MCP抑制了它的表达。原生质体瞬时表达结果表明，EIN3家族成员RhEIN3-3强烈诱导了RhGAI1的启动子活性。通过EMSA方法，验证了RhEIN3-3与RhGAI1启动子的直接结合。此外，RhGAI1调节了花瓣细胞的扩展，在拟南芥中过表达RhGAI1，抑制了花瓣细胞的扩展，而在月季花瓣中沉默RhGAI1，则促进了花瓣细胞的扩展。RhGAI1调节了一系列细胞扩展相关功能基因的表达。其中，RhGAI1沉默的月季花瓣中，RhCesA2的表达受到明显的诱导。通过EMSA实验，验证了RhGAI1和RhCesA2启动子的直接结合。这些结果表明，响应乙烯的生长抑制子RhGAI1作用于RhEIN3-3的下游，调控了RhCesA2等一系列细胞扩展相关的下游功能基因的转录，从而参与了乙烯调节的月季花瓣扩展过程。. 研究还发现，受乙烯诱导的SNAC类转录因子RhNAC3提高了花瓣失水胁迫耐性。外源乙烯、ABA、失水、机械伤害等诱导了RhNAC3的表达。通过酵母单杂交和拟南芥叶肉细胞原生质体实验表明RhNAC3全长和C-端具有转录激活活性。此外，通过病毒诱导基因沉默的方法，在月季花瓣中沉默了RhNAC3，导致其失水胁迫耐性降低，复水后细胞的扩展能力下降。再者，我们将RhNAC3异源过表达在拟南芥中，过表达植株干旱胁迫耐性显著提高，并且转基因植株的离体叶片水分损失率显著下降。. 上述结果初步阐明了月季花瓣中RhGAI1和RhNAC3响应乙烯影响花瓣扩展和参与失水胁迫耐性的转录调节机制，为进一步改良月季采后品质提供了基因储备。项目实施以来，发表SCI论文4篇，培养博士4人硕士3人。