粪肥农用导致土壤四环素抗性基因扩散剖面分异的机制解析

The bacteria having drug resistance and concomitantly the pollution of their antibiotics resistance genes are extensively and intensively reported for now. The information of the fates and distributions of antibiotics resistance genes released into environments is of great help towards the prediction and control of these genes transportation and diffusion. In this project, the long-term field manure experiment will be conducted to investigate the types, destinies and distributions of tetracycline resistance genes among microorganism and in different soil layers at Changshu Agro-ecological Experimental Station, Chinese Academy of Sciences, Changshu, Jiangsu Province, China. Our purpose is to figure out the factors influencing the distribution of tetracycline resistance microorganisms and their genes in different soil layers, which will contribute to the prediction and control of antibiotics resistance microorganisms and their genes in ecological system.

细菌抗药性和抗性基因污染问题是当前的研究热点。深入研究抗生素抗性基因释放于环境后的归趋、动态消长规律是控制抗性基因在环境中的传播与扩散的有效途径之一。本项目利用中国科学院常熟生态试验站的长期定位粪肥农用试验平台，通过田间小区观测与实验室微宇宙模拟相结合，利用荧光定量PCR、rep-PCR、454高通量测序等手段，研究长期施用粪肥后不同土层和细菌种群中四环素抗性基因的种类、归趋及分布特征，探讨长期施用粪肥引起的土壤微生物种群多样性变化对抗性菌和抗性基因存留扩散的影响，明确四环素抗性菌和抗性基因在不同土层分布差异和在土壤中存留扩散的关键影响因素，从而为科学预测和控制抗性菌和抗性基因的生态风险提供理论依据。

项目基于中国科学院常熟生态试验站的长期定位试验平台，通过田间小区观测与实验室微宇宙模拟相结合，利用现代分子技术深入研究了苏南地区典型水稻土（乌栅土）中，因长期施用新鲜粪肥和腐熟粪肥（有机肥）后，土壤中四环素抗性菌和抗性基因种类、剖面分布差异的变化，及其年际累积规律，并分析了其关键影响因素，结果表明：（1）粪肥的施用显著改变了土壤中TRGs的种类组成和丰度；凡施用粪肥，土壤中主要的TRGs都是tetG、tetZ、tetL和tetB(P)，说明携带这4种TRGs的细菌适应乌栅土和稻麦轮作模式的能力较强。（2）施用新鲜粪肥增加了土壤中四环素抗性细菌的种类，而施用发酵粪肥减少了土壤中四环素抗性细菌的种类。同时，施用粪肥明显改变了土壤中tetL的基因组成；施用发酵猪粪显著降低土壤中tetG和tetL的多样性。（3）长期施用粪肥的土壤中，微生物多样性指数与主要抗性基因的丰度负相关。土壤微生物群落对粪肥携带的四环素抗性细菌在土壤中繁殖和四环素抗性基因相对数量的增加发挥了重要的抑制作用，其中可能其主要作用的是Acidobacteria、Armatimonadetes、Chlorobi、Chloroflexi、Elusimicrobia、Gemmatimonadetes、Nitrospirae、Planctomycetes细菌。（4）在乌珊土水稻土体系，引起粪肥施用后土壤中抗性细菌和抗性基因数量增加的主要原因是粪肥中抗性细菌的存活和繁殖及其携带的抗性基因的扩散；粪肥中不被活体细菌携带的胞外抗性基因（非活体抗性基因）对土壤抗性基因的增加并无显著贡献，而且对土壤中抗性细菌的相对数量也无明显影响；同时，猪粪中的养分对抗性基因的增加无显著贡献。（5）推测在营养丰富的上层土壤，土壤颗粒的大小可能通过影响土壤通气状况或者抗性细菌淋溶迁移速度来影响抗性的分布；而在养分相对较少的下层土壤，磷的含量成为影响微生物繁殖进而影响抗性分布的主要因素。本项目结果可为科学预测抗性菌和抗性基因的生态风险，有机废弃物资源的管理和合理利用提供理论基础。